短，流體熱容小，具有分析檢 測(cè)速度快、反應(yīng)均一性好等特性。在本實(shí)施案例中，芯片通道寬為50um~4mm，通道高為50um ~500um。芯片通道底面預(yù)先經(jīng)過(guò)羧基/醛基/環(huán)氧基/鏈霉親合素化學(xué)基團(tuán)表面修飾。 液路系統(tǒng)
[0041] 在各個(gè)實(shí)施例中，液路系統(tǒng)包括試劑倉(cāng)(包括產(chǎn)物倉(cāng)、廢液倉(cāng)）、注射器、多通道閥 門(mén)、微栗和微管、壓力/流量傳感器等。其中試劑倉(cāng)為反應(yīng)試劑的存儲(chǔ)設(shè)備，并可根據(jù)不同試 劑設(shè)定不同的存儲(chǔ)環(huán)境溫度;微栗則是試劑溶液在芯片通道中流動(dòng)的動(dòng)力引擎，其可通過(guò) 注射器進(jìn)行正壓推動(dòng)或負(fù)壓抽取的方法，來(lái)控制流體的流動(dòng)或靜止;微管則是試劑倉(cāng)、廢液 倉(cāng)連接微流控芯片通道的流路通道，可稱為系統(tǒng)的血管系統(tǒng)；多通道閥門(mén)則是控制不同試 劑流入芯片通道，廢液、產(chǎn)物在不同倉(cāng)室的收集，通過(guò)預(yù)設(shè)的參數(shù)和系統(tǒng)的控制，多通道閥 門(mén)進(jìn)行自動(dòng)的切換實(shí)現(xiàn)不同試劑在特定時(shí)間的引入或流出。另外，工作站也可裝配壓力傳 感器，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)通道內(nèi)試劑溶液的性質(zhì)，包括試劑泄漏、溶液流量及體積等，在反應(yīng)過(guò) 程中用戶可根據(jù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行維護(hù)，包括原件的更換;尤其在出現(xiàn)報(bào)錯(cuò)故障時(shí)，基于 監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)可對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行故障排除和調(diào)試。 溫控裝置
[0042] 在各個(gè)實(shí)施例中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)及單堿基延伸反應(yīng)，包括dsDNA變性解鏈為ssDNA和 延伸產(chǎn)物的變性游離，需集成在微流控芯片中完成;反應(yīng)過(guò)程涉及:PCR溫度循環(huán)如95°C (變 性）-55°C(退火)_72°C(延伸），且變性反應(yīng)在采用熱變性處理過(guò)程中，溫度亦需在95°C左 右;這就需要微流工作站設(shè)有溫控裝置，且緊貼芯片底面。溫控裝置要具有實(shí)現(xiàn)溫度的精確 控制、良好的溫度均一性及較快的升降溫速度的特性。在實(shí)施例中，溫控裝置可采用帕爾貼 加熱片(Peltier heating plates)或其他加熱/冷卻裝置，設(shè)有：高導(dǎo)熱的金屬/陶瓷平板 和芯片能夠緊密貼合，風(fēng)扇或冷卻裝置能夠?qū)崿F(xiàn)迅速的降溫且防止過(guò)熱現(xiàn)象，溫度傳感器 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)芯片的溫度，PID控制器實(shí)時(shí)控制溫度按照用戶預(yù)設(shè)溫度曲線進(jìn)行加熱/降溫等。 控制系統(tǒng)
[0043] 在各個(gè)實(shí)施例中，控制系統(tǒng)為微流工作站的大腦，其耦連液路系統(tǒng)和溫控裝置，在 整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，能夠控制系統(tǒng)各器件按照用戶預(yù)設(shè)參數(shù)自動(dòng)運(yùn)行。其包括電源控制模塊、 信息采集處理模塊、單片機(jī)、輸入/輸入信號(hào)模塊、可視化操作界面等;其中電源控制模塊， 為各部件供電；信息采集處理模塊連接壓力、溫度、流量傳感器，并傳輸至單片機(jī);單片機(jī)為 微型處理器;輸入/輸出信號(hào)模塊可向單片機(jī)輸入信號(hào)或接受單片機(jī)輸出信號(hào)，并輸出至各 部件;可視化操作界面則可顯示實(shí)時(shí)系統(tǒng)參數(shù)，并用戶可通過(guò)其預(yù)設(shè)參數(shù)，包括PCR反應(yīng)溫 度，反應(yīng)時(shí)間，試劑流速等。
[0044] 本發(fā)明公開(kāi)了一種基于微流控芯片作為反應(yīng)腔室和固相載體，通過(guò)功能集成的微 流工作站，在微流控芯片中同一個(gè)反應(yīng)通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸，并對(duì)延 伸產(chǎn)物/含有SNP位點(diǎn)的核酸序列進(jìn)行富集、分離、提純，以進(jìn)行基因檢測(cè)和其他用途。
[0045] 本發(fā)明公開(kāi)了一種基于微流控芯片，在一個(gè)反應(yīng)腔室內(nèi)實(shí)現(xiàn)固相PCR擴(kuò)增和固相 單堿基延伸反應(yīng)，包括在微流控芯片通道底面提供的固相襯底錨定連接的反向引物。參考 圖1，原理方法包括以下步驟:將含有PCR反應(yīng)液、dNTP、DNA模板/全血、正向引物的混合液引 入固相襯底錨定連接有反向引物的芯片通道，在經(jīng)過(guò)反復(fù)的變性、退火、延伸后生成含有反 向引物的目標(biāo)ssDNA和含有正向引物的互補(bǔ)ssDNA，兩條ssDNA互補(bǔ)生成dsDNA，并通過(guò)反向 引物固定在通道底面（見(jiàn)110);通過(guò)變性處理，包括化學(xué)方式（如通入堿溶液）或熱處理， dsDNA發(fā)生變性解鏈，互補(bǔ)ssDNA發(fā)生游離，引入清洗緩沖液對(duì)反應(yīng)通道進(jìn)行反復(fù)的清洗，洗 脫掉游尚的互補(bǔ)ssDNA、未反應(yīng)引物和dNTP等，即對(duì)錯(cuò)定在固相襯底的目標(biāo)ssDNA進(jìn)彳丁提純， 其中清洗緩沖液經(jīng)連接芯片出口的毛細(xì)微管和多通道閥門(mén)的選擇性開(kāi)啟，被引入至廢液倉(cāng) (見(jiàn)120);接著，將含有PCR反應(yīng)液、ddNTP、單堿基延伸引物的混合液引入到芯片通道，在經(jīng) 過(guò)反復(fù)的退火-延伸后，單堿基延伸引物雜交到目標(biāo)ssDNA，延伸一個(gè)堿基即終止，且錨定在 固相襯底（見(jiàn)130);再次引入清洗緩沖液對(duì)通道進(jìn)行反復(fù)清洗，洗脫掉未反應(yīng)延伸引物、 ddNTP等，即對(duì)錨定在固相襯底的ssDNA和延伸產(chǎn)物進(jìn)行提純，再經(jīng)過(guò)去離子水的洗脫去鹽， 最后進(jìn)行加熱變性處理，延伸產(chǎn)物發(fā)生解鏈游離，回收含有游離延伸產(chǎn)物的去離子水，此時(shí) 切換多通道閥門(mén)，開(kāi)啟產(chǎn)物倉(cāng)閥門(mén)，含有游離延伸產(chǎn)物的去離子水引入至產(chǎn)物倉(cāng)(見(jiàn)140)。 反應(yīng)的終溶液即可直接MALDI-T0F-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀)上機(jī)，進(jìn)行 質(zhì)譜檢測(cè)，生成SNP位點(diǎn)報(bào)告。
[0046] 上述的實(shí)驗(yàn)步驟都在微流控芯片中進(jìn)行，又稱為微流控芯片實(shí)驗(yàn)室或芯片實(shí)驗(yàn) 室，其特征主要是其容納流體的有效結(jié)構(gòu)至少在一個(gè)維度上為微米級(jí)尺度。微流控芯片可 由金屬、硅片、玻璃和聚合物中的至少一個(gè)或組合組成。微流控芯片可采用微細(xì)加工技術(shù)進(jìn) 行制造，如模塑法、光刻化學(xué)腐燭方法等，其包括進(jìn)出口、流道和反應(yīng)腔室。根據(jù)不同需求和 實(shí)現(xiàn)功能，可加工成不同形狀和尺寸的芯片:芯片流道可為圓形通過(guò)或方形通道，反應(yīng)腔室 可為單個(gè)腔室或多個(gè)腔室串聯(lián)/并聯(lián)，通道尺寸可為l〇um~2_，甚至更小。
[0047]在本發(fā)明的實(shí)施案例中，采用固相PCR擴(kuò)增和固相單堿基延伸反應(yīng)原理，所有反應(yīng) 都集成在同一個(gè)反應(yīng)腔室中實(shí)現(xiàn)，在實(shí)施過(guò)程中能夠?qū)Ψ磻?yīng)試劑實(shí)現(xiàn)精確控制和集成操 作，但并不局限，亦可在兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)腔室。圖2適宜性地描述了本發(fā)明采用的微流控芯 片，包括芯片的進(jìn)口 210、出口 220、上蓋230、反應(yīng)通道240和基底250。在芯片的加工實(shí)施案 例中，芯片加工方案可由兩種實(shí)現(xiàn)方案，但并不局限，兩層結(jié)構(gòu)和三層結(jié)構(gòu)。如圖3A示意的 兩層結(jié)構(gòu):上蓋310和基底320,上蓋打孔作為通道的進(jìn)出口，基底進(jìn)行刻蝕挖槽作為反應(yīng)流 道；如圖3B示意的三層結(jié)構(gòu)：上蓋330、通道柵欄340和基底350,上蓋打孔作為通道的進(jìn)出 口，柵欄則為反應(yīng)流道間隔；如圖3C示意，通過(guò)對(duì)分層結(jié)構(gòu)進(jìn)行鍵合封裝，形成可進(jìn)出流通 的封閉反應(yīng)腔室，包括進(jìn)出口360、370和通道380。在實(shí)施例中，微流控芯片具有8個(gè)并行的 反應(yīng)通道，每個(gè)通道僅含有單一的反應(yīng)腔室;但并不局限，亦可為1，2,4,10，16個(gè)并行的通 道，每個(gè)通道又可含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的反應(yīng)腔室，如兩個(gè)串行的反應(yīng)腔室，分別進(jìn)行樣本 的PCR預(yù)擴(kuò)增和單堿基延伸反應(yīng)。但單個(gè)通道有嚴(yán)格的封閉性，不會(huì)與其他并行通道有溶液 試劑的流通，避免不同樣本的交叉污染。
[0048]在本發(fā)明的實(shí)施案例中，微流控芯片采用兩層結(jié)構(gòu)加工方案如圖3A所示:上蓋為 無(wú)堿玻璃材質(zhì)，基底為硅晶圓材質(zhì)，尺寸為L(zhǎng)*W*H= 7.5cm*2.5cm*0.1_，與普通玻片大小相 近。首先，對(duì)無(wú)堿玻璃、硅晶圓切割成上述尺寸;然后按照芯片設(shè)計(jì)圖形上分別對(duì)玻璃、硅片 進(jìn)行打孔、刻蝕挖槽，即玻璃上蓋設(shè)置有進(jìn)出口，硅片基底設(shè)有微流通道，通道長(zhǎng)度為6cm， 深度為50um-200um，寬度為0.5mm~3mm，單個(gè)反應(yīng)通道的反應(yīng)體系總體積為5ul~20ul;其 次，對(duì)芯片上蓋、基底進(jìn)行超聲清洗，除去殘留雜質(zhì)并烘干處理;接著對(duì)固相襯底進(jìn)行羧基/ 醛基/環(huán)氧基/鏈霉親合素表面修飾處理;最后利用光刻膠粘合鍵合技術(shù)，在硅片非通道區(qū) 域均勻涂膠，對(duì)準(zhǔn)硅片和玻璃上蓋輕壓后，進(jìn)行紫外光照鍵合，完成微流控芯片的制作后對(duì) 其進(jìn)行真空密封4°C留存。
[0049] 在本發(fā)明的實(shí)施案例中，上述固相襯底表面修飾處理的方法流程，給出硅片醛基 化修飾的具體步驟，包括： A、 采用過(guò)氧化氫和濃硫酸按照v/v=l:3的比例進(jìn)行處理，使硅片表面高度羥基化； B、 采用無(wú)水乙醇對(duì)硅片進(jìn)行反復(fù)清洗后，利用硅烷化試劑APTMS，使硅片表面的羥基氨 基化； C、 采用無(wú)水乙醇、去離子水對(duì)硅片反復(fù)清洗后，利用戊二醛試劑，使硅片表面的氨基醛 基化。
[0050] 在本發(fā)明的實(shí)施案例中，如示意圖4，微流工作站包括微流控芯片、液路系統(tǒng)、溫控 裝置和控制系統(tǒng)。
[0051 ]在本發(fā)明的實(shí)施案例中，