As-pcr引物設(shè)計(jì)方法、基因多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸診斷試劑領(lǐng)域，具體設(shè)及一種改進(jìn)的等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(AS-PCR)引物設(shè)計(jì)方法。本發(fā)明還設(shè)及一種改進(jìn)的AS-PCR基因多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑 盒，所述方法及試劑盒用于對(duì)可能（即懷疑)包含等位基因變異區(qū)域的祀序列進(jìn)行檢測(cè)W確 定等位基因變體是否存在。
【背景技術(shù)】
[0002] 等位基因特異性寡核巧酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO)是基 于雜交的突變檢測(cè)技術(shù)，常用W檢測(cè)已知突變。設(shè)計(jì)一段例如15~20bp的寡核巧酸片段，其 中包含了發(fā)生已知突變的部位，W此為探針，當(dāng)與固定在膜上的樣品DNA雜交時(shí)，由于一個(gè) 堿基的差異會(huì)導(dǎo)致Tm值下降5~7.5°C，因此通過嚴(yán)格控制雜交條件，可W鑒定出樣品DNA中 是否存在突變。
[0003] 將AS0與PCR相結(jié)合的等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(AS-PCR)是目前一種常用 于分析基因多態(tài)性，特別是單核巧酸多態(tài)性(SNP)的方法。多態(tài)性(polymor地ism)是指在一 個(gè)生物群體中，同時(shí)和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型(genotype)或等位基 因（allele)，亦稱遺傳多態(tài)性(genetic polymor曲ism)或基因多態(tài)性。從本質(zhì)上來講，多態(tài) 性產(chǎn)生于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功 能的區(qū)域。單核巧酸多態(tài)性(SNP)，即散在的單個(gè)堿基的不同，包括單個(gè)堿基的缺失、插入和 置換，其中W單個(gè)堿基置換的情形居多。SNP是目前倍受關(guān)注的一類多態(tài)性，由于其經(jīng)常在 遺傳疾病、疾病易感性、藥物不良反應(yīng)性等研究中具有遺傳標(biāo)記的作用，因此，其檢測(cè)為疾 病診斷和早期診斷，藥物學(xué)研究等提供了巨大的潛在可能。
[0004] 在AS-PCR中，PCR的引物之一或者兩個(gè)引物被設(shè)計(jì)成在序列變異的位點(diǎn)處退火，使 其能夠區(qū)分同一基因的不同等位基因，運(yùn)些等位基因類型包括堿基的替換、插入和缺失。 AS-PCR利用了 DNA聚合酶的保真度:相比于3 '端最后一個(gè)堿基正確匹配引物而言，3 '端最后 一個(gè)堿基錯(cuò)配的引物在延伸效率上大大降低(通常為1/100至1/1〇〇,〇〇〇)。3'端最后一個(gè)堿 基錯(cuò)配的引物由此導(dǎo)致延伸困難，PCR擴(kuò)增減少，因此很容易通過檢測(cè)區(qū)分突變。
[0005] 傳統(tǒng)AS-PCR的引物3 '端最后一個(gè)堿基特別關(guān)鍵，必須為基因多態(tài)性位點(diǎn)。W檢測(cè) SNP為例，其原理如圖1所示。圖1A中，針對(duì)包含SNP位點(diǎn)的祀序列設(shè)計(jì)等位基因特異性引物 (下稱AS引物）1 -1、1 -2，即，在常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，使待iiSNP位點(diǎn)恰好位于AS引物1 -1、1-2的3'末端，即引物1-1與1-2僅3'末端的堿基不同（分別對(duì)應(yīng)野生型和可能的突變型）， 其余堿基序列一致，其中5 '端X代表堿基上的徑基或憐酸基，3 '端Y代表堿基上的徑基。圖1B 中，2-1和2-2分別為等位基因所在的野生型和突變型DNA雙鏈，其中2-化和2-化分別為與AS 引物配對(duì)的模板鏈。如圖1C所示，按照3'端最后一個(gè)堿基嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)的原理，實(shí)現(xiàn)等位基 因的特異性擴(kuò)增。也就是說，若圖1A中的AS引物與圖1B中的模板完全互補(bǔ)配對(duì)，則形成圖1C 中3-U3-2所示雙鏈結(jié)構(gòu)，PCR反應(yīng)順利進(jìn)行，若形成圖1C中3-3、3-4所示情況，3'末端堿基 錯(cuò)配，貝化CR反應(yīng)不可進(jìn)行。通過分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，判定SNP情況，若引物1-2擴(kuò)增而引物1-1 無明顯擴(kuò)增，則表明存在所述突變。
[0006] 傳統(tǒng)AS-PCR對(duì)DNA聚合酶的要求比較高。PCR(非AS-PCR)反應(yīng)體系中常用的DNA聚 合酶有A型和B型兩種，A型DNA聚合酶具有5 '端到3 '端的DNA聚合酶活性，如化q DNA聚合酶 等;B型DNA聚合酶不但具有5 '端到3 '端的DNA聚合酶活性，還具有3 '端到5 '端的DNA外切酶 活性，可W即時(shí)識(shí)別并切除3'端的錯(cuò)配堿基（因錯(cuò)配導(dǎo)致翅起），從而剩下未錯(cuò)配的堿基得 W繼續(xù)擴(kuò)增，例如pfu DNA聚合酶、K0D DNA聚合酶，等等。由于傳統(tǒng)AS-PCR正需要利用多態(tài) 性位點(diǎn)的錯(cuò)配引物，故而擴(kuò)增反應(yīng)中僅能使用A型DNA聚合酶，不能使用會(huì)將錯(cuò)配堿基切除 的B型DNA聚合酶。
[0007] 圖2A和2B示意性地示出了 A型和B型DNA聚合酶在傳統(tǒng)PCR體系中的作用情況。其 中，圖2A是A型DNA聚合酶在傳統(tǒng)PCR體系中的作用情況，當(dāng)引物(3'端為徑基)與模板完全匹 配時(shí)，在A型DNA聚合酶作用下引物得W擴(kuò)增（左），而當(dāng)引物3'端與模板錯(cuò)配時(shí)，退火溫度下 錯(cuò)配部分翅起，不能與模板結(jié)合，A型DNA聚合酶不起作用，引物不能擴(kuò)增(右），利用此特性， 傳統(tǒng)AS-PCR得W實(shí)現(xiàn)等位基因多態(tài)性的檢測(cè)；圖2B是B型DNA聚合酶在傳統(tǒng)PCR體系中的作 用情況，當(dāng)引物與模板完全匹配時(shí)，在B型DNA聚合酶作用下引物得W擴(kuò)增(左），而當(dāng)引物3' 端與模板錯(cuò)配時(shí)，錯(cuò)配部分翅起，B型DNA聚合酶先發(fā)揮3 '端到5 '端的DNA外切酶作用，將錯(cuò) 配部分切除，剩下未錯(cuò)配的引物在DNA聚合酶作用下得W繼續(xù)擴(kuò)增(右），運(yùn)樣顯然無法用于 傳統(tǒng)AS-PCR中鑒別等位基因多態(tài)性。
[000引傳統(tǒng)AS-PCR技術(shù)存在W下缺點(diǎn)：
[0009] 第一、由于AS引物要針對(duì)待測(cè)突變型進(jìn)行設(shè)計(jì)，故而傳統(tǒng)AS-PCR技術(shù)僅能對(duì)已知 的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不能檢測(cè)未知的突變類型。
[0010] 第二、傳統(tǒng)AS-PCR技術(shù)在檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果方面，一種是采用電泳分析方法，運(yùn)種方式 操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，成本高，且技術(shù)較難普及;另一種是采用實(shí)時(shí)巧光定量PCR，運(yùn)也需要額外合 成標(biāo)記有巧光基團(tuán)和巧光巧滅基團(tuán)的巧光探針。
[0011] 因此，業(yè)界存在改良傳統(tǒng)AS-PCR技術(shù)的需要。在屬于同一權(quán)利人的中國發(fā)明專利 化201410106312.0中，提出了一種新的AS-PCR技術(shù)，其中對(duì)AS-PCR引物進(jìn)行修飾，使所述 AS-PCR引物的3 '端最后一個(gè)堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團(tuán)，并且使用 B型DNA聚合酶進(jìn)行的PCR反應(yīng)，使得所述經(jīng)修飾的AS-PCR引物在與模板鏈錯(cuò)配時(shí)延伸，而與 模板鏈互補(bǔ)時(shí)不延伸。
[001引由于上述設(shè)計(jì)的AS-PCR引物3'端具有能夠屏蔽引物直接延伸的基團(tuán)，當(dāng)與模板 DNA結(jié)合時(shí)，若引物與模板完全互補(bǔ)，由于引物的3 '進(jìn)行了去徑基化修飾，無法與dNTP發(fā)生 聚合反應(yīng)，因此引物不延伸。反之，若引物與模板錯(cuò)配，即不完全互補(bǔ)，則退火時(shí)錯(cuò)配部分翅 起不與模板結(jié)合，此時(shí)B型DNA聚合酶的3'端到5'端外切酶活性起作用，將引物3'端翅起的 不互補(bǔ)配對(duì)的部分切除，剩余引物部分的3'端徑基露出（DNA鏈上dNTP之間的憐酸二醋鍵在 B型DNA聚合酶作用下水解后，引物3 '端產(chǎn)生徑基，水解下的dNTP或DNA鏈的5 '端形成憐酸 基），如此，酶切后的引物即可在DNA聚合酶作用下延伸。
[001引圖3A和3B示意性地示出了 B型DNA聚合酶在上述AS-PCR體系中的作用原理。圖3A中 引物3'端連接有屏蔽引物延伸的基團(tuán)Y'，圖3B中引物5'端連接有巧光基團(tuán)X0,3'端連接有 澤滅基團(tuán)Υο。當(dāng)引物與模板完全匹配時(shí)，由于3'端徑基被屏蔽，引物無法擴(kuò)增（左），而當(dāng)引 物3 '端堿基與模板錯(cuò)配時(shí)，退火溫度下錯(cuò)配部分翅起，Β型DNA聚合酶先發(fā)揮3 '端到5 '端的 DM外切酶作用，將錯(cuò)配部分切除，剩下未錯(cuò)配的引物在DM聚合酶作用下得W繼續(xù)擴(kuò)增 (右)。
[0014] 因此，與傳統(tǒng)AS-PC時(shí)目反，上述AS-PCR引物只有在錯(cuò)配時(shí)才延伸，而與模板鏈互補(bǔ) 時(shí)則不延伸，運(yùn)樣就可W不區(qū)分突變類型而檢測(cè)等位基因多態(tài)性是否存在。具體而言，如果 某一等位基因存在多種可能的突變，例如單個(gè)或多個(gè)堿基插入、缺失或替換，而人們僅需要 檢測(cè)樣品是否存在突變而不必確定具體的突變類型時(shí)，則可W僅針對(duì)野生型設(shè)計(jì)AS-PCR引 物，若擴(kuò)增表明樣品存在突變，反之不擴(kuò)增表明樣品為野生型。較之傳統(tǒng)AS-PCR引物，其在 與模板鏈互補(bǔ)時(shí)延伸而發(fā)生錯(cuò)配則不延伸，故要針對(duì)每一種突變?cè)O(shè)計(jì)引物，運(yùn)種新方法的 優(yōu)點(diǎn)顯而易見。
[0015] 隨著堿基標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步，目前在引物序列任何位置標(biāo)記巧光基團(tuán)或者澤滅基團(tuán) 都是容易實(shí)現(xiàn)的，例如生工生物、Thermoscientific都有此類服務(wù)。所W本發(fā)明人在上一個(gè) 專利基礎(chǔ)上進(jìn)行了進(jìn)一步研發(fā)，獲得了一種新的AS-PCR引物設(shè)計(jì)方法，該方法針對(duì)祀序列 的等位基因變異區(qū)域(包括SNPW及一個(gè)或多個(gè)堿基插入或缺失)來設(shè)計(jì)引物，用W確定該 等位基因變異區(qū)域的具體類型。該方法不但提供了一種不同于化201410106312.0技術(shù)的替 代方案，而且在B型DNA聚合酶為3'徑基依賴型的情況下仍然可W正常發(fā)揮作用（由于 化201410106312.0技術(shù)中引物的3 '進(jìn)行了去徑基化修飾，3 '徑基依賴型B型DNA聚合酶可能 不發(fā)揮作用）。因而從DNA聚合酶的適用范圍而言，本發(fā)明的方法比化201410106312.0技術(shù) 更有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)一部分將在下面的描述中列出，另一部分對(duì)于本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員來說容易基于下面的描述而想到。
[0017] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種AS-PCR引物的設(shè)計(jì)方法，所述方法包括W下步驟： (i)針對(duì)包含待測(cè)等位基因變異區(qū)域的祀序列設(shè)計(jì)AS-PCR引物；（ii)對(duì)步驟（i)所設(shè)計(jì)的 AS-PCR引物進(jìn)行修飾，在引物5'端1~8個(gè)堿基內(nèi)標(biāo)記一巧光基團(tuán)，對(duì)等位基因變異區(qū)域的 堿基用澤滅基團(tuán)標(biāo)記；（iii)在步驟（ii)所設(shè)計(jì)的AS-PCR引物3'端額外合成1~3個(gè)與待測(cè) 基因不互補(bǔ)的堿基。利用本發(fā)明上述方法設(shè)計(jì)的引物可用于確定待測(cè)等位基因是否與已知 基因類型不同的AS-PCR反應(yīng)，例如用于區(qū)分野生