1 ]序列1和序列2的模板DM分別進(jìn)行了梯度稀釋后（Ipg/ul、lOpg/ul、lOOpg/ul、 10(K)pg/ul)，用于巧光PCR擴(kuò)增。
[0052] 模板用量:ddH2〇(即0)、化g/反應(yīng)、20pg/反應(yīng)、200pg/反應(yīng)、2000pg/反應(yīng)。
[0053] 1.5.使用的循環(huán)參數(shù):95攝氏度5分鐘
[0054] (95攝氏度10秒58攝氏度45秒）10個(gè)循環(huán)
[0055] (95攝氏度10秒60攝氏度45秒)35個(gè)循環(huán)
[0056] 1.6.巧光定量PCR檢測(cè):使用Bio-rad CFX96巧光PCR儀。
[0057] 1.7.結(jié)果:濃度分別為 Opg/ul、Ipg/ul、lOpg/ul、lOOpg/ul、lOOOpg/ul 的樣品的 Ct 值見(jiàn)下表1。
[005引 表1
[0059]
[0060] 7"表示陰性樣品，無(wú)此SNP位點(diǎn)；"N"表示檢測(cè)結(jié)果為陰性;模板加入量(序列1+序 列2)指MTHFR序列1和MTHFR序列2放入PCR反應(yīng)中的量。
[0061 ] 1.8.結(jié)果判定方法:若^(￥1(：，〇和^巧41，1')都大于35，則說(shuō)明樣品濃度低或有 抑制，需重做。若Ct(VIC，C)或Ct(FAM，T)中有一個(gè)Ct值小于32,則按如下結(jié)果判定：
[0062] i)、Ct (VIC，C)-Ct (FAM，T) <-1，則判斷SNP位點(diǎn)為CC純合型；
[0063] 1〇、抗(￥1(：，〇-抗化施，1')〉1，則判斷5^位點(diǎn)為1'1'純合型；
[0064] iii)、-KCt(VIC，C)-Ct(FAM，T)<l，則判斷 SNP 位點(diǎn)為 CT 雜合型。
[0065] 試驗(yàn)證實(shí)，各樣品檢測(cè)結(jié)果均與測(cè)序背景一致；其中樣品1結(jié)果為陰性，樣品2為 SNP位點(diǎn)為C的純合型樣品，樣品3為SNP位點(diǎn)為T(mén)的純合型樣品，樣品4和5為雜合型樣品。參 見(jiàn)圖5,圖5A為純合型樣品的典型擴(kuò)增曲線，其兩條引物之一顯示擴(kuò)增曲線，但都有擴(kuò)增產(chǎn) 物;圖5B為雜合型樣品的典型擴(kuò)增曲線，其兩條引物均有擴(kuò)增。 巧066] 實(shí)施例2.人EGFR基因變異引物設(shè)計(jì)和其應(yīng)用:
[0067] 本實(shí)施例針對(duì)人EGFR基因第19外顯子的突變熱點(diǎn)區(qū)可能發(fā)生的多種突變進(jìn)行不 區(qū)分突變類型的突變檢測(cè)，其中選取了 64種突變類型，合成模板序列進(jìn)行驗(yàn)證。
[0068] 2.1.人EGFR引物設(shè)計(jì)：
[0069] 人EGFR-01用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)突變基因、人EGFR-02用于檢測(cè)總的EGFR基因數(shù)量、人 EGFR-03為下游引物。（SNP類型見(jiàn)表4，E-1為EGFR野生型DNA序列，E-2~E-65為發(fā)生突變的 基因序列，其中帶下劃線為基因缺失的區(qū)域，斜體為基因突變后與野生型有區(qū)別的序列區(qū) 域）
[0070] 表2: EGFR的突變類型
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]人EGFR-01:5，-AAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAca-3，
[00巧]人EGFR-02:5，-GTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTAca-3，
[0076] 人EGFR-03:5 '-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3 '
[0077] 2.2.引物修飾：
[007 引 人EGFR-01:5 '（FAM)-AAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTA(B冊(cè)1)ca-3 '
[0079] 人EGFR-02:5 '（VIC)-GTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTA(B冊(cè)1)ca-3 '
[0080] 2.3.模板合成：
[0081 ] 合成人EGFR序列E-1~E-65作為模板DNA:
[0082]
[0083]
[0084]
[008引 2.4.配液:按照下面濃度配制反應(yīng)液:211^(1饑1\2.511111肖2+、11]/反應(yīng)8型0臟聚合 酶（pfu DNA聚合酶）、10mM P冊(cè).3Tris、50mM KCl、0.1pmol/ul引物人EGFR-01、0.1pmol/ul 引物人EGFR-02、Ο. Ipmol/ul引物人EGFR-03、模板DM，加水至體積為20ul。
[0086]其中模板DNA分別進(jìn)行 了梯度稀釋后（Ipg/ul、lOpg/ul、lOOpg/ul、lOOOpg/ul)，用 于巧光PCR擴(kuò)增。
[0087]模板用量:ddH2〇、化g/反應(yīng)、20pg/反應(yīng)、200pg/反應(yīng)、2000pg/反應(yīng)。 [008引2.5.使用的循環(huán)參數(shù):95攝氏度5分鐘
[0089] (95攝氏度10秒58攝氏度45秒）10個(gè)循環(huán)
[0090] (95攝氏度10秒60攝氏度45秒)35個(gè)循環(huán)
[0091] 2.6.巧光定量PCR儀儀器:Bi〇-rad CFX96巧光PCR儀。
[0092] 2.7.結(jié)果:取50pg/ul的合成DNA做模板，檢測(cè)的Ct值見(jiàn)下表4。
[0093]
[0094]

[0096] 2.8.結(jié)果判定方法:若^(￥1(：，胖)和^巧41，1)都大于35，則說(shuō)明樣品濃度低或有 抑制，需重做。若Ct(VIC，W)或Ct(FAM，M)中有一個(gè)Ct值小于32,則按如下結(jié)果判定。
[0097] 1)、抗化施，]\〇-抗(￥1(：，胖)<6，則判斷66。1?發(fā)生突變；
[009引 10、抗化施，]\〇-抗(￥1(：，胖)〉6，則判斷66尸尺為野生。
[0099] 試驗(yàn)證實(shí)，各樣品檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況一致。證明了按照本發(fā)明的方法，針對(duì)人 EGFR基因的突變熱點(diǎn)區(qū)域，僅采用針對(duì)野生型位點(diǎn)設(shè)計(jì)的AS-PCR引物，即可檢測(cè)出該基因 突變熱點(diǎn)區(qū)域多種突變類型。
[0100] 因此，W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用W限制本發(fā)明，本發(fā)明要求保 護(hù)的范圍由權(quán)利要求書(shū)W及其等同替換方式所限定，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的 任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種AS-PCR引物的設(shè)計(jì)方法，所述方法包括以下步驟： (i) 針對(duì)包含待測(cè)等位基因變異區(qū)域的靶序列設(shè)計(jì)AS-PCR引物； (ii) 對(duì)步驟（i)所設(shè)計(jì)的AS-PCR引物進(jìn)行修飾，在引物5'端1~8個(gè)堿基內(nèi)標(biāo)記一熒光 基團(tuán)，對(duì)等位基因變異區(qū)域的堿基用淬滅基團(tuán)標(biāo)記； (iii) 在步驟（ii)所設(shè)計(jì)的AS-PCR引物3'端額外合成1~3個(gè)與待測(cè)基因不互補(bǔ)的堿 基。2. -種AS-PCR基因多態(tài)性檢測(cè)方法，所述方法用于對(duì)可能包含等位基因變異區(qū)域的靶 序列進(jìn)行檢測(cè)以確定等位基因變體是否存在，其特征在于所述方法包括以下步驟： (i) 針對(duì)包含待測(cè)等位基因變異區(qū)域的靶序列設(shè)計(jì)AS-PCR引物； (ii) 對(duì)步驟（i)所設(shè)計(jì)的AS-PCR引物進(jìn)行修飾，在引物5'端1~8個(gè)堿基內(nèi)標(biāo)記一熒光 基團(tuán)，對(duì)等位基因變異區(qū)域的堿基用淬滅基團(tuán)標(biāo)記； (iii) 在步驟（ii)所設(shè)計(jì)的AS-PCR引物3'端額外合成1~3個(gè)與待測(cè)基因不互補(bǔ)的堿 基； (i v)使用步驟（i i i)所修飾的AS-PCR引物對(duì)所述靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增使 用B型DNA聚合酶； (v)分析步驟(iv)的擴(kuò)增結(jié)果確定所述等位基因變體是否存在。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟(i)中所述等位基因變異區(qū)域位于所述AS-PCR引物的3 '端的第1~6個(gè)堿基中，所述引物的長(zhǎng)度為18bp~30bp。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中使在擴(kuò)增反應(yīng)中所述AS-PCR引物的5 '端到所述 等位基因變異區(qū)域的Tm值為48°C~52°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述熒光基團(tuán)選自下列物質(zhì)所構(gòu)成的組:FAM、 VIC、HEX、ROX、Taxas Red或CY5,所述熒光淬滅基團(tuán)選自下列物質(zhì)所構(gòu)成的組:BHQ1、BHQ2、 BHQ3、Dabcyle、Temrai^Eclipse〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述B型DNA聚合酶為pfu DNA聚合酶或KOD DNA 聚合酶。7. -種AS-PCR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其中至少包含以下成分： a. 根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法步驟(i)-(iii)所設(shè)計(jì)的AS-PCR引物； b. 根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法步驟(iv)中使用的B型DNA聚合酶。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種AS-PCR引物設(shè)計(jì)方法、基因多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒，所述方法及試劑盒用于對(duì)可能包含等位基因變異區(qū)域的靶序列進(jìn)行檢測(cè)以確定等位基因變體是否存在。所述AS-PCR引物設(shè)計(jì)方法包括以下步驟：(i)針對(duì)包含待測(cè)等位基因變異區(qū)域的靶序列設(shè)計(jì)AS-PCR引物；(ii)對(duì)步驟(i)所設(shè)計(jì)的AS-PCR引物進(jìn)行修飾，在引物5’端1～8個(gè)堿基內(nèi)標(biāo)記一熒光基團(tuán)，對(duì)等位基因變異區(qū)域的堿基用淬滅基團(tuán)標(biāo)記；(iii)在步驟(ii)所設(shè)計(jì)的AS-PCR引物3’端額外合成1～3個(gè)與待測(cè)基因不互補(bǔ)的堿基。相較于傳統(tǒng)AS-PCR單一的檢測(cè)位點(diǎn)能力，本發(fā)明的基因多態(tài)性引物設(shè)計(jì)方法和檢測(cè)方法及試劑盒可以兼并識(shí)別突變位點(diǎn),并且可以將探針和引物合二為一，節(jié)約了引物合成成本、設(shè)計(jì)時(shí)間，設(shè)計(jì)也方便易懂，容易掌握。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105506101
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511015817
【發(fā)明人】劉小芳, 李丙亮
【申請(qǐng)人】李丙亮
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年12月29日