CRISPR-Cas9特異性敲除豬GFRA1基因的方法及用于特異性靶向GFRA1基因的sgRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及基因敲除技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及 CRISPR-化s9特異性敲除豬GFRA1基因的方法及用于特異性祀向GFRA1基因的sgRNA。
【背景技術(shù)】
[0002] 器官移植是治療器官衰竭疾病最有效的治療手段。迄今為止，全球已有近百萬的 患者通過器官移植而延續(xù)生命。隨著人口老齡化及醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，需要進(jìn)行器官移植手 術(shù)的病人越來越多，但供體器官的短缺嚴(yán)重制約了器官移植手術(shù)的開展。W腎臟移植為例， 我國(guó)每年需要進(jìn)行腎移植的患者多達(dá)30萬，而可用于移植的捐獻(xiàn)腎臟不超過1萬例，大部 分患者死于腎衰竭。依靠死后器官捐獻(xiàn)已不能滿足器官移植的需要。通過基因工程改造其 他物種，W提供合適于人體移植的器官，成為解決人類供體器官短缺問題的主要途徑。
[0003] 目前，根據(jù)生物安全性、生理功能指標(biāo)、經(jīng)濟(jì)性及稀有物種保護(hù)等多方面評(píng)價(jià)，豬 成為了最為理想的異種器官來源。但豬和人之間存在巨大的差異，直接將豬的器官移植到 人會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。因此，通過基因工程對(duì)豬進(jìn)行改造，W產(chǎn)生適合于人體移植 的器官，成為異種移植的終極目標(biāo)。
[0004] 傳統(tǒng)的技術(shù)路線通過減少豬與人的免疫差異W獲得可用于移植的豬的品系。近年 來，利用器官發(fā)育缺陷型豬作為培養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)生由人類細(xì)胞構(gòu)成的器官成為新的思路。通過 基因工程有效干擾控制豬自身器官發(fā)育的基因，使豬在發(fā)育過程中某個(gè)器官缺失，從而為 人源細(xì)胞器官的發(fā)育提供了關(guān)鍵的培養(yǎng)環(huán)境。
[0005] 目前已知GFRA1基因是腎臟發(fā)育中的必需基因。GFRA1全稱GDNF家族受體al地a 1，在進(jìn)化上高度保守。GFRA1作為受體參與GDNF信號(hào)的傳遞，介導(dǎo)輸尿管上皮與后腎間質(zhì) 間的信號(hào)反饋，對(duì)于輸尿管芽進(jìn)入間質(zhì)組織是必需的。缺失GFRA1基因會(huì)導(dǎo)致新生鼠腎發(fā) 育不全或缺失。利用GFRA1基因敲除技術(shù)能夠使豬在發(fā)育過程中不產(chǎn)生腎臟，為人類細(xì)胞 來源腎提供了良好的發(fā)育環(huán)境。而準(zhǔn)確高效的敲除豬的GFRA1基因，是首要步驟。
[0006] 目前，常見的基因敲除技術(shù)包括同源重組化omologus Recombination, HR)技術(shù)、 類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子核酸酶（Transcription Activator-Uke Effector Nuclease, TALEN) 技術(shù)、鋒指核酸酶狂inc-Finger Nuclease, ZFN)技術(shù)W及最近發(fā)展的規(guī)律成簇間隔短回 文重復(fù)（Clustered Regularly Interspaced 化ort Palin化omic R巧eat, CRISPR)技術(shù)。 皿技術(shù)由于重組效率低下（效率大約只有10 6)，對(duì)突變體的篩選工作非常耗時(shí)和低效，已 逐漸被取代。TALEN技術(shù)和ZFN技術(shù)的切割效率一般能達(dá)到20%，但都需要構(gòu)建可W識(shí)別 特定序列的蛋白質(zhì)模塊，前期工作繁瑣費(fèi)時(shí)。ZFN技術(shù)的模塊設(shè)計(jì)較為復(fù)雜且有較高的脫祀 率，其應(yīng)用有限。
[0007] CRISIS是一種源于原核生物的后天免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)執(zhí)行干擾功能的復(fù)合物由蛋 白質(zhì)Cas和CRISPR-RNA(crRNA)組成。目前該系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)有Ξ種類型，其中第二類化s9 系統(tǒng)組成簡(jiǎn)單，已被積極應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域。化s9祀向切割DM是通過兩種小RNA-一 crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)與祀序列互補(bǔ)識(shí)別的原理實(shí)現(xiàn) 的?，F(xiàn)在已經(jīng)將兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡(jiǎn)稱sgRNA(single guide RNA)，能夠識(shí)別 特定的基因序列，引導(dǎo)化s9蛋白進(jìn)行切割。在真核生物中，DNA被切斷后發(fā)生非同源重組 末端連接，造成移碼突變，最終導(dǎo)致基因功能性敲除。
[0008] 相比于上述3種技術(shù)，CRISPR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、篩選效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)精確的祀向切 害d。因此，通過CRISPR技術(shù)敲除GFRA1基因能夠極大地提高GFRA1缺失細(xì)胞及腎發(fā)育缺失 基因工程豬的篩選效率。但是該路徑的關(guān)鍵技術(shù)難題是設(shè)計(jì)并制備精確祀向的sgRNA，因?yàn)?基因的祀向精確度高度依賴于sgRNA祀序列，能否成功設(shè)計(jì)出精確祀向的sgRNA成為敲除 目的基因的關(guān)鍵技術(shù)問題，本發(fā)明意在解決該技術(shù)問題從而為敲除GFRA1基因提供堅(jiān)實(shí)的 基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供CRISPR-化s9特異性敲除豬GFRA1基因的方法及用于特異 性祀向GFRA1基因的SgRNA。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供在CRISPR-化s9特異性敲除豬GFRA1基因中 用于特異性祀向GFRA1基因的SgRNA,該SgRNA具有W下特點(diǎn)： W11] (1)該SgRNA在GFRA1基因上的祀序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列規(guī)則，其 中N (20)表示20個(gè)連續(xù)的堿基，其中每個(gè)N表示A或T或C或G，符合上述規(guī)則的祀序列位 于正義鏈或反義鏈； 陽〇1引 似該SgRNA在GFRA1基因上的祀序列位于GFRA1基因的N端的5個(gè)外顯子編碼 區(qū)，或祀序列的一部分位于GFRA1基因的N端的5個(gè)外顯子，其余部分跨越與相鄰內(nèi)含子的 交界，位于相鄰內(nèi)含子； 陽〇1引 （3)該SgRNA在GFRA1基因上的祀序列是唯一的。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述祀序列為序列表中SEQ ID NO :1~50中任一條序列 所示的序列。
[0015] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述祀序列為序列表中SEQ ID NO :1或4所示的序列。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供運(yùn)用CRISPR-化s9特異性敲除豬GFRA1基因 的方法，該方法包括如下步驟：
[0017] (1)在第一方面所述的SgRNA的祀序列的5'-端加上用于形成粘性末端的序列， 合成得到正向寡核巧酸序列；在第一方面所述的SgRNA的祀序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列的兩端加 上合適的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核巧酸序列；將合成的正向寡核巧酸 序列與反向寡核巧酸序列退火、復(fù)性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核巧酸；
[0018] (2)將上述雙鏈寡聚核巧酸連入線性化的攜帶化s9基因的表達(dá)載體，得到攜帶含 相應(yīng)祀序列的SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選鑒定出正 確的陽性克隆，并對(duì)陽性克隆搖菌、提取質(zhì)粒；
[0019] (3)用上述攜帶有SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表達(dá)載體、包裝質(zhì)粒和包裝細(xì) 胞系包裝出同時(shí)攜帶祀向GFRA1基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0020] (4)使用上述假型慢病毒感染目的細(xì)胞，并進(jìn)一步培養(yǎng)；然后收集被感染的目的 細(xì)胞，W其基因組DNA為模板擴(kuò)增包含上述祀序列的基因片段，經(jīng)過變性、復(fù)性及酶切，確 定GFRAl基因的敲除情況。
[0021] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述表達(dá)載體為序列表中SEQ ID NO :51所示序列的載 體。
[0022] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述方法包括如下步驟： 陽02引 （1)在第一方面所述的sgRNA的祀序列的5'-端加上CACCG序列，合成得到正向 寡核巧酸序列；在第一方面所述的sgRNA的祀序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列的5'-端加上AAAC序 列、3'-端加上C，合成得到反向寡核巧酸序列；將合成的正向寡核巧酸序列與反向寡核巧 酸序列退火、復(fù)性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核巧酸；
[0024] (2)將上述雙鏈寡聚核巧酸連入如序列表中SEQ ID NO :51所示序列的表達(dá)載體 lentiCRISPR v2經(jīng)BsmB I限制性內(nèi)切酶酶切得到的線性化載體，得到攜帶SgRNA寡聚核巧 酸的重組表達(dá)載體lentiCRISPR V2-GFRA1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選鑒定出正確的陽性克隆， 并對(duì)陽性克隆搖菌、提取質(zhì)粒；
[0025] (3)用上述表達(dá)載體lentiCRISPR V2-GFRA1、包裝質(zhì)粒和包裝細(xì)胞系包裝出同時(shí) 攜帶祀向GFRA1基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0026] (4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的細(xì)胞，并進(jìn)一步培養(yǎng)；然后收集被感染 的目的細(xì)胞，W其基因組DNA為模板擴(kuò)增包含上述祀序列的基因片段，經(jīng)過變性、復(fù)性及酶 切，確定GFRA1基因的敲除情況。
[0027] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述包裝質(zhì)粒為質(zhì)粒pLPl、質(zhì)粒pLP2和質(zhì)粒pLP/VSVG ; 上述包裝細(xì)胞系為肥K293T細(xì)胞。
[0028] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述目的細(xì)胞為豬PIEC細(xì)胞。
[0029] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述W其基因組DNA為模板擴(kuò)增包含上述祀序列的基因 片段，經(jīng)過變性、復(fù)性及酶切，確定GFRA1基因的敲除情況，具體為：
[0030] (a) W感染病毒的目的細(xì)胞的基因組DNA為模板，用GFRA1基因的上下游引物擴(kuò)增 包含上述SgRNA的祀序列的GFRA1基因片段，同時(shí)用相同引物擴(kuò)增未感染病毒的野生型細(xì) 胞的基因組DNA ; 陽03U (b)純化上述擴(kuò)增到的GFRAl基因片段，然后將來自感染病毒的目的細(xì)胞的GFRAl 基因片段和來自野生型細(xì)胞的GFRAl基因片段分別加熱變性、復(fù)性，形成雜交DM分子； 陽0扣](C)用化uiser酶切割復(fù)性后的雜交DNA分子；
[003引 （d)電