體系放入PCR儀，并按W下程序進(jìn)行反應(yīng)。 陽(yáng)104] 反應(yīng)程序： 陽(yáng) 10引 95°C，5min; 陽(yáng) 106] 80 °C , 5min ； 陽(yáng) 107] 70 °C , 5min ； 陽(yáng) 108] 60 °C , 5min ； 陽(yáng) 109] 50 °C , 5min ；
[0110] 自然降至室溫。 陽(yáng)111] 2.構(gòu)建SgRNA表達(dá)載體 陽(yáng)11引 （1)利用BsmB I限制性?xún)?nèi)切酶酶切目標(biāo)載體lentiCRISPR v2質(zhì)粒（其序列如序 列表中SEQ ID NO :51所示）。
[0113] 按照W下反應(yīng)體系進(jìn)行配制：
[0114] LentiCRISPR v2 質(zhì)粒：1 μ g
[0115] 10 X 酶切 buffer :2 μ L 陽(yáng)116] BsmB I限制性?xún)?nèi)切酶：2 μ L
[0117] 補(bǔ)充d地2〇至總體積20 μ L
[0118] 將酶切反應(yīng)體系置于37°C反應(yīng)4h。
[0119] (2)電泳分離并純化載體片段
[0120] 酶切結(jié)束后，將酶切混合物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，選擇載體片段（約 12化）進(jìn)行切割，并通過(guò)DNA凝膠回收柱進(jìn)行回收。 陽(yáng)121] (3)將合成的雙鏈DNA片段與載體主片段進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 陽(yáng)12引將復(fù)性得到的雙鏈DNA片段與回收得到的載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)，按照W下反應(yīng) 體系進(jìn)行配制：
[0123] LentiCRISPR v2 載體片段：100ng
[0124] 雙鏈 DM 片段：200ng
[0125] T4 連接酶：1μΙ
[0126] Τ4 連接反應(yīng) buf f er : 1 μ L 陽(yáng)127] 補(bǔ)充(1地2〇至總體積10 μ L
[0128] 將連接混合物置于25 °C反應(yīng)化。
[0129] 反應(yīng)結(jié)束后將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)α菌株：向連接混合物中加入100 μ L 大腸桿菌D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，冰上解育30min ;將混合物放入42°C水浴，熱激90s后放入冰 上冷卻；向混合物加入100 μ L LB培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)20min ;將混合物涂Amp LB平板， 37°C培養(yǎng)1地。
[0130] (4)鑒定正確的轉(zhuǎn)化克隆 陽(yáng)131] 從Amp LB平板上挑選若干菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。挑選可能 正確的克隆進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證插入序列是否正確。對(duì)于正確的lentiCRISPR V2-GFRA1載體克 隆進(jìn)行保種。 陽(yáng)13引實(shí)施例三獲得表達(dá)GFRAlsgRNA的假型慢病毒
[0133] 1.材料準(zhǔn)備
[0134] 擴(kuò)增并抽提包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG(購(gòu)自Invitrogen，其圖譜分別如 圖2、圖3和圖4所示）；擴(kuò)增并抽提載體質(zhì)粒lentiCRISPR V2-GFRA1 ;培養(yǎng)包裝細(xì)胞系 肥K293T細(xì)胞（購(gòu)自ATCC) ;DMEM培養(yǎng)基、化ti-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清FBS (購(gòu)自Gibco); Lipofectamine2000(購(gòu)自 Invitrogen);肥K293T 細(xì)胞培養(yǎng)于含 5% C〇2的 37°C培養(yǎng)環(huán)境 中，培養(yǎng)基為含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基。
[0135] 2.轉(zhuǎn)染和病毒包裝 陽(yáng)136] 第一天：將包裝細(xì)胞系肥K293T傳代至10cm dish,約30%融合度；
[0137] 第二天：在肥K293T達(dá)到80 %融合度時(shí)按照下列配方進(jìn)行轉(zhuǎn)染： 陽(yáng)13引配制混合物1，包含： 陽(yáng) 139] lentiCRISPR V2-GFRA1 :6μ邑
[0140] pLPl :6 μ g
[0141] pLP2 :6 μ g
[0142] pLP/VSVG:3y 邑
[0143] 0pti-MEM:500 yL。
[0144] 配制混合物2,包含：
[0145] Lipofectamine 2000:30 μ L
[0146] Opti-MEM :500 μ L。
[0147] 靜置5min后，將混合物1和混合物2混勻成轉(zhuǎn)染混合物，靜置20min。
[0148] 將肥K293T培養(yǎng)基換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染混合物，37°C培養(yǎng)化后換為 20 % FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0149] 3.病毒收集與保存
[0150] 第Ξ天：轉(zhuǎn)染4化后收集含病毒的肥K293T培養(yǎng)基上清，用0. 45 μ m濾頭過(guò)濾后， 分裝，放置-80 °C保存。
[015U 實(shí)施例四、感染目的細(xì)胞并檢測(cè)祀序列的敲除效果
[0152] 1.材料準(zhǔn)備 陽(yáng)153] 培養(yǎng)目的細(xì)胞系豬髓動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞PIEC(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清FBS (購(gòu)自Gibco);不同祀序列（序列1和序列4)的lentiCRISPR V2-GFRA1假型慢病毒；PIEC細(xì)胞培養(yǎng)于含5% C〇2的37°C培養(yǎng)環(huán)境中，培養(yǎng)基為含10% FBS 的DMBl培養(yǎng)基。 陽(yáng)154] 2.慢病毒感染目的細(xì)胞 陽(yáng)1巧]第一天：將目的細(xì)胞傳代至6孔板，約20%融合密度。每一種病毒需要一個(gè)6孔， 同時(shí)需要效率對(duì)照一個(gè)6孔。 陽(yáng)156] 第二天：待目的細(xì)胞約40%融合密度時(shí)加入1血lentiCRISPR V2-GFRA1假型慢 病毒上清及ImL DMEM培養(yǎng)基。效率對(duì)照不需要添加慢病毒。 陽(yáng)157] 第Ξ天：感染24h后去除含病毒培養(yǎng)基，換成正常培養(yǎng)基，加入嚷嶺霉素至終濃度 2 μ g/mU沒(méi)有感染病毒的效率對(duì)照樣品也同時(shí)加入嚷嶺霉素作為對(duì)照，培養(yǎng)4她。
[0158] 3.細(xì)胞感染效率檢測(cè)和培養(yǎng)
[0159] 第五天：未感染的效率對(duì)照細(xì)胞在嚷嶺霉素的作用下應(yīng)該全部調(diào)亡（>95% )。根 據(jù)感染慢病毒細(xì)胞的調(diào)亡情況判斷細(xì)胞的感染效率，通?？蒞達(dá)到90% W上的感染效率 (調(diào)亡率<10% )。必要時(shí)可W將病毒上清進(jìn)行濃縮或梯度稀釋后進(jìn)行感染W(wǎng)達(dá)到合適的感 染效率。
[0160] 經(jīng)過(guò)嚷嶺霉素篩選后，未感染的細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。將目的細(xì)胞重新傳代并換為普通 培養(yǎng)基培養(yǎng)4她。 陽(yáng)16U 4.檢測(cè)GFRA1基因敲除效果 陽(yáng)16引 （1)設(shè)計(jì)上下游引物朗Γ增GFRA1基因片段，其中上下游引物序列如下所示：
[0163] CTCTCACTGGATGGAGCTGAACTTTG(沈Q ID NO :56)
[0164] GCTCAGACCCTATAATTTCCTGCCAG(SEQ ID NO :57)。 陽(yáng)1化]目的擴(kuò)增片段包含sgRNA祀序列，大小為46化P。祀序列至片段兩端的位置不少于 lOObp。
[0166] 似收集部分目的細(xì)胞，使用promega基因組DM試劑盒抽提基因組DM。同時(shí)抽 提野生型目的細(xì)胞的基因組DNA。
[0167] (3) W基因組DNA為模板擴(kuò)增包含祀序列的GFRA1基因片段（包括感染的突變樣 品和野生型樣品）。 陽(yáng)168] 擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μ L)如下： 陽(yáng)169] 上游引物（ΙΟμΜ) :1 μL 陽(yáng)170] 下游引物（ΙΟμΜ) :1 μL
[0171] 2XPCR Mix :10μΙ 陽(yáng)17引 基因組DNA:100ng
[0173] W上述反應(yīng)體系進(jìn)行配制，放入PCR儀，并按下列程序進(jìn)行反應(yīng)。 陽(yáng)174] 反應(yīng)程序： 陽(yáng) 175] 95 °C , 3min 陽(yáng) 176] 95°C , 30s 陽(yáng) 177] 58°C , 20s 陽(yáng) 17引 72°C，20s 陽(yáng) 179] 72 °C , 3min ；
[0180] 其中第二步至第四步重復(fù)35個(gè)循環(huán)。 陽(yáng)1W] (4)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并回收純化 陽(yáng)1扣](5)將純化后的DNA片段分別加熱變性、復(fù)性，形成雜交DNA分子（包括突變樣品 和野生型樣品）。 陽(yáng)183] 反應(yīng)體系如下所示：
[0184] 基因組PCR片段：200ng 陽(yáng)化5] 5 X 反應(yīng) buf f er : 2 μ L 陽(yáng)186] 反應(yīng)體系共9 μ L
[0187] W上述反應(yīng)體系進(jìn)行配制，放入PCR儀，并按下列程序進(jìn)行反應(yīng)。 陽(yáng)188] 反應(yīng)程序： 陽(yáng)化 9] 95°C，5min; 陽(yáng) 190] 80 °C , 5min ；
[0191] 70°C , 5min ； 陽(yáng)19引 6(TC，5min; 陽(yáng) 19引 50°C , 5min ; 陽(yáng)194]自然降至室溫。 陽(yáng)1巧](6)用化uiser酶切割復(fù)性后的雜交DNA (包括突變樣品和野生型樣品） 陽(yáng)196] 向經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性的反應(yīng)混合物加入1 μ L化uiser酶，45°C解育20min。 陽(yáng)197] (7)電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，檢測(cè)祀序列介導(dǎo)的GFRA1基因敲除效果。
[0198] 將經(jīng)過(guò)酶切的DNA片段用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，100V，25min。確定目的 片段的切割情況，判斷祀序列的基因敲除效果。 陽(yáng)199] 對(duì)突變DNA的切割識(shí)別基于W下原理：經(jīng)過(guò)感染的細(xì)胞會(huì)表達(dá)sgRNA和化s9?；?因組DNA如果被sgRNA介導(dǎo)的化s9蛋白祀向切割，經(jīng)過(guò)修復(fù)后會(huì)在切割位點(diǎn)附近引入突變 (野生型變?yōu)橥蛔冃停?。由于野生型和突變型序列在該位置不匹配，w此為模板擴(kuò)增出的野 生型DNA與突變型DNA經(jīng)過(guò)變復(fù)性形成的雜交分子會(huì)就產(chǎn)生局部的環(huán)形（loop)結(jié)構(gòu)。而 后者可W被化uiser酶識(shí)別并切斷，導(dǎo)致雜交DNA