ηΜ、92. 59ηΜ、 30. 86ηΜ、10. 29ηΜ、3. 43ηΜ、1. 14ηΜ、0. 38ηΜ、0. 13ηΜ、0. 04ηΜ。
[0109] 各種其他試劑配制：
[0110] 用ALK激酶緩沖液分別配制所需要的5 X ALK激酶溶液、5 X底物溶液、5 X ATP溶 液，備用。
[0111] ALK酶學反應：
[0112] 1)384孔板中相對應的孔中分別加入4μ L配制好的2. 5X測試物溶液、2 μ L配制 好的5XALK激酶溶液，25°C孵育10分鐘。
[0113] 2)相對應的孔中再分別加入2 μ L配制好的5X底物溶液和2 μ L配制好的5XATP 溶液，啟動酶反應，25°C孵育30分鐘。
[0114] 酶學檢測：
[0115] 用檢測緩沖液（detection buffer)配制所需濃度的SA-XL665,然后和等體積的 酪氨酸激酶抗體混勻，相對應的孔中分別加入10 μ L配制好的此抗體溶液，終止反應。25°C 孵育lh。
[0116] 酶標儀 665nm/615nm 讀板。
[0117] IC5。：計算抑制率（％ )=(最大值一樣本值V(最大值一最小值）X100,采用 Graph prisim軟件進行曲線擬合，得出IC5。值。
[0118] 最大值：不加化合物的陽性對照，最小值：不加酶的陰性對照。
[0119] 實驗結果和結論：
[0120] 表1本發(fā)明化合物的體外酶學抑制活性
[0121]
[0122] 由表1可見，本發(fā)明化合物對ALK激酶具有良好的抑制活性，可用于治療與激酶相 關的疾病，特別是ALK激酶介導的病癥或病況，具有顯著的臨床意義。
[0123] 實駘例2本發(fā)明化合物的體外酶學活件實騎
[0124] 測試物：本發(fā)明化合物1、2,其化學名稱和制備方法請見各化合物的制備實施例。
[0125] 對照藥Ceritinib，自制（參考專利W02008/073687 A2制備方法制備）。
[0126] 實驗方法：采用Caliper Mobility Shift方法進行ALK激酶的抑制活性測定
[0127] 1. 1倍激酶緩沖液配制
[0128] 分別取ρΗ7· 5的HEPES、濃度為30 %的Brij-35、母液濃度為1M的MgCl2溶液、 母液濃度為1M的DTT，加入超純水混勻，使HEPES的終濃度為50mM，Bri j-35的終濃度為 0. 0015%，MgCl2的終濃度為10mM，DTT的終濃度為2mM。
[0129] 2.終止液的配制
[0130] 分別取母液濃度為4%的包被液Coating Reagent#3(Caliper儀器所使用的 12-sipper chip中自帶包被液）、母液濃度為lOOOmM pH7. 5的HEPES、母液濃度為0. 5M 的EDTA、母液濃度為30%的Bri j-35,加入超純水混勻，使Coating Reagent#3終濃度為 0. 2%，HEPES 終濃度為 lOOmM，EDTA 終濃度為 50mM，Brij-35 終濃度為 0. 015%。
[0131] 3. 5倍測試物溶液配制
[0132] 測試物的DMS0儲備液配制：分別稱取化合物適量（具體稱樣量請見下表），加入 適量DMS0溶解，混勻，備用。
[0133]
[0134] 取測試物的DMS0儲備液，用DMS0稀釋制成濃度為50 μ Μ的溶液，作為母液。用 DMS0將上述母液四倍逐級稀釋，然后每個濃度分別用1倍激酶緩沖液稀釋10倍，制成5倍 測試物溶液。
[0135] 4.各種其他試劑的配制
[0136] 用1倍激酶緩沖液分別配制所需要的2. 5倍ALK激酶溶液、2. 5倍多肽溶液，備用。
[0137] 5.酶學反應
[0138] 1) 384孔板中相對應的孔中分別加入5 μ L配制好的5倍測試物溶液、10 μ L配制 好的2. 5倍激酶溶液，室溫孵育10分鐘。
[0139] 2)相對應的孔中再分別加入10 μ L配制好的2. 5倍多肽溶液，使測試物終濃度為 1000ηΜ、250ηΜ、63ηΜ、16ηΜ、4ηΜ、1ηΜ、0· 2ηΜ、0· 1ηΜ、0· 02ηΜ、0· 004nM。啟動酶反應，28?孵育 1小時。
[0140] 6.酶學檢測
[0141] 每個相對應的孔中分別加入25 μ L終止液，終止反應。Caliper儀器讀取數(shù)據(jù)，并 通過數(shù)據(jù)計算抑制率，
[0142] 抑制率（％ )=(最大值-樣本值V (最大值-最小值）X 100,采用XLFIT軟件 進行曲線擬合，得出IC5。值。
[0143] 最大值：不加測試物的陽性對照，最小值：不加酶的陰性對照。
[0144] 實驗結果和結論：
[0145] 表2本發(fā)明化合物的體外酶學抑制活性
[0146]
[0147] 由表2可見，本發(fā)明化合物對ALK激酶具有良好的抑制活性，可用于治療與激酶相 關的疾病，特別是ALK激酶介導的病癥或病況，具有顯著的臨床意義。
[0148] 實駘例3本發(fā)明化合物的體外細朐活件實騎
[0149] 測試物：本發(fā)明化合物1、2,其化學名稱和制備方法見各化合物的制備實施例。
[0150] 對照藥Ceritinib，自制（參考專利W02008/073687 A2制備方法制備）。
[0151] 下述中實驗的縮寫所代表的含義如下：
[0152] rpm:轉每分鐘
[0153] DMS0:二甲基亞砜
[0154] MTS:溴化噻唑藍四氮唑
[0155] RPMI1640 :1640 培養(yǎng)基（RPMI: Roswell Park Memorial Institute)
[0156] 500X、1000X、10X 其中的 "X"：倍
[0157] 實驗方法：
[0158] (一）NCI-H3122 細胞：
[0159] (1)細胞制備：
[0160] 用含10%胎牛血清、1001]/1111青霉素、10011^/1111鏈霉素的1?^1-1640培養(yǎng)基，在 5% C02、37°C條件的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)細胞至80%融合，備用。
[0161] (2)接種細胞：
[0162] 用胰酶消化細胞，lOOOrpm離心4min，去除上清液，用含2. 5 %胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基重新混懸，調整細胞密度，取該細胞混懸液90 μ L接種到96孔板中，獲得 最終細胞密度為3000個/孔；然后在5% C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0163] (3)加入測試物：
[0164] (3· 1)測試物溶液配制
[0165] 測試物溶液配制：分別稱取測試物適量（具體稱樣量請見下表），加入適量DMS0 溶解并分別用DMS0梯度稀釋制成一系列濃度的母液（1000 X測試物溶液），再分別用培養(yǎng) 基稀釋該母液100倍得到10 X測試物溶液，分別取該溶液10 μ L，加入到96孔板相應的孔 中，得到各測試物溶液最終濃度為：1〇μΜ、2. 5μΜ、625ηΜ、156ηΜ、39ηΜ、9. 8ηΜ、2. 5ηΜ。
[0166]
[0167] (3.2)對照孔設置：
[0168] 溶媒對照：0· 1 % DMSO。
[0169] 細胞對照：只接種細胞，不加化合物。
[0170] 空白對照：培養(yǎng)基，儀器調零。
[0171] (3. 3)將96孔板放37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
[0172] (4)檢測：
[0173] MTS檢測方法：
[0174] ①將CellTiter 9#?單溶液96孔細胞增殖檢測試劑盒中的試劑室溫放置90min。
[0175] ②向96孔板的每個試驗孔中加入CellTiter %?. AQueous單溶液試劑20 μ L。
[0176] ③將96孔板放5% C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min。
[0177] ④設置酶標儀檢測波長490nm，讀取結果。
[0178] (5)結果處理：
[0179] IC5。計算：細胞存活率（％ ) = (0D樣本值一0D空白值）/ (0D最大值一0D空白值）X100,米 用Graph prisim軟件進行曲線擬合，得出IC5。值。
[0180] 0D最大值：不加化合物只加溶媒的細胞對照，0D空白值：空白對照值。
[0181] (二）NCI-H2228 細胞：
[0182] (1)細胞制備：
[0183] 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在5% C02、37°C條件的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)細 胞至80 %融合，備用。
[0184] (2)接種細胞：
[0185] 用胰酶消化細胞，lOOOrpm離心4min，去除上清液，用含2. 5 %胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基重新混懸，調整細胞密度2 X 104個/mL，取該細胞混懸液100 μ L接種到 96孔板中，獲得最終細胞密度為：2000個細胞/孔。
[0186] (3)加入測試物：
[0187] (3. 1)測試物溶液配制：分別稱取測試物適量（具體稱樣量請見下表），加入適量 DMS0,溶解，混勻，將溶液用DMS0梯度稀釋，得到各一系列濃度的溶液，備用。
[0188]
[0189] 取99 μ L培養(yǎng)基分別加入到96孔板每一孔中，然后取上述配制好的不同濃度的 溶液1 μ L加入到對應的孔中，使得化合物和對照藥Ceritinib的最終濃度為：10000nM、 2500nM、625nM、156. 25nM、39. 06nM、9. 77nM、2. 44nM、0. 61nM。
[0190] (3. 2)對照孔設置：
[0191] 溶媒對照：0· 5 % DMSO。
[0192] 細胞對照：只接種細胞，不加化合物。
[0193] 空白對照：培養(yǎng)基，儀器調零。
[0194] (3. 3)將此96孔板放5% C02、37°C條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。
[0195] (4)檢測：
[0196] CTG檢測方法：
[0197] ①將96孔板每孔中培養(yǎng)基移除80 μ L，室溫平衡30min。
[0198] ②向96孔板的每個試驗孔中加入CellTiter- Gl〇?試劑60 μ L。
[0199] ③96孔板用微孔板振蕩器避光振蕩混勻2min，使細胞裂解。
[0200] ④將96孔板避光室溫孵育lOmin，使產(chǎn)生的光信號值穩(wěn)定。
[0201] ⑤酶標儀在luminescence模式下讀取結果。
[0202] (5)結果處理：
[0203] IC50計算：細胞抑制率（％ ) = (0D最大值一0D化合物V(0D最大值一0D空白）X 100,采用 Graph prisim軟件進行曲線擬合，得出IC5。值。
[0204] 0D^tt :不加化合物只加溶媒的的細胞對照，0Dse :培養(yǎng)基空白對照
[0205] 實驗結果：
[0206] 表3本發(fā)明化合物的細胞抑制活性
[0207]
[0208] 由表3可見，本發(fā)明化合物對細胞NCI-H3122和NCI-H2228均具有良好的抑制活 性，可用于治療ALK激酶介導的病癥或病況，具有顯著的臨床意義。
【具體實施方式】
[0209] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下實施例。凡基于本發(fā)明上述內容 所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
[0210] 下述縮寫所代表的定義如下：
[0211] DMF:N，N_二甲基甲酰胺
[0212] Boc:叔丁氧基羰基
[0213] TFA:三氟乙酸
[0214] DMS0:二甲基亞砜
[0215] EA:乙酸乙酯
[0216] TEA:三氟乙酸
[0217] THF:四氫呋喃
[0218] DIEA:N，N_ 二異丙基乙胺
[0219] 實施例1 5_氯_N2-(6_異丙氧基異口引口朵嚇_5_基）_#_(2_(異丙基磺酉先基）苯 某）嘧啶-2, 4-二胺的制各
[0220]
[0221] (1)4-羥基鄰苯二甲酸二甲酯的制備
[0223] 將4-羥基鄰苯二甲酸（50g, 274. 5mmol)溶于甲醇（800mL)中，冷卻至10°C，攪拌 下緩慢滴加硫酸（134g，1. 37mol)，滴加完畢后升溫至70°C反應過夜。冷卻至室溫，真空濃 縮，加入乙酸乙酯（700mL)，水洗（500mLX3)，有機相用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮得到產(chǎn) 物（32g，產(chǎn)率 55% )。
[0224] (2)4-羥基-5-硝基鄰苯二甲酸二甲酯的制備
[0225]