一種復合菌劑及其在煙葉醇化中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種復合菌劑及其在煙葉醇化中的應用，屬于煙葉增香處理技術領 域。
【背景技術】
[0002] 在煙葉醇化發(fā)酵階段，增加特定的微生物可有效縮短煙葉醇化發(fā)酵時間、調控煙 葉中主要化學成分的含量（降低煙葉煙堿含量、降低煙葉蛋白質、降低氨基酸含量、降低 TSNA)、增加煙葉香氣前體物含量。
[0003] 很多研究結果表明，通過改進煙葉微生物發(fā)酵條件或者加入多種物質，可明顯提 高煙葉內在品質，降低煙葉雜氣和刺激性。如Seaaich等報道在卷煙前6天噴灑鏈格抱的抱 子懸浮液可大大提高煙葉的香氣。Wentiligy等研究發(fā)現(xiàn)，某些酵母菌菌株接種醇化煙葉 上，3天后可誘發(fā)煙葉產生誘人的香氣。趙銘欽等研究發(fā)現(xiàn)，用微生物處理煙葉后，明顯改善 煙葉香氣質量，雜氣及刺激性減小。CN104207324A公開了一種保藏號CCTCC M2013150為枯 草芽抱桿菌，將其接種于煙葉并進行發(fā)酵，結果顯示可提高煙葉致香物質的含量。但上述方 法改善效果有限。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提出一種復合菌劑W及其在煙葉醇化中的應用。將復合菌劑用于 煙葉醇化中，可提高煙葉香氣物質含量，改善煙葉醇化品質，為開發(fā)具有獨特風格特色煙葉 打下基礎。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0006] -種復合菌劑，由枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、解淀粉酶芽抱桿菌混合而成；其 中，枯草芽抱桿菌的活菌數(shù)不小于109c化/ml，地衣芽抱桿菌的活菌數(shù)不小于109c化/ml，解 淀粉酶芽抱桿菌的活菌數(shù)不小于109C化/ml。
[0007] 其中，所述枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌均分離自茅臺酒曲；其中，所述枯草芽抱 桿菌經鑒定為枯草芽抱桿菌MTLBOUBacillus subtilis MTLB01)，保藏編號為CCTCC N0:M 2015575,保藏日期為2015年9月25日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（簡稱CCTCC，地址： 中國武漢武漢大學，郵編:430072);
[000引所述地衣芽抱桿菌經鑒定為地衣芽抱桿菌MTLB02(Bacillus licheniformis MTLB02)，保藏編號為CCTCC N0:M 2015576,保藏日期為2015年9月25日，保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中屯、(簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學，郵編:430072)。
[0009] 本發(fā)明所述解淀粉酶芽抱桿菌則選擇本領域技術人員所理解的常規(guī)解淀粉酶芽 抱桿菌即可，如市售購買或自行培養(yǎng)所得。
[0010] 作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述復合菌劑中，枯草芽抱桿菌的活菌數(shù)109cfu/ ml，地衣芽抱桿菌的活菌數(shù)109c化/ml，解淀粉酶芽抱桿菌的活菌數(shù)109c化/ml。
[0011] 本發(fā)明所述的復合菌劑中，所述枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌的獲取步驟如下：
[0012] 1)將茅臺酒曲黑色部分接種于PDA平板培養(yǎng)基中，于48-50°C培養(yǎng)23-24h，挑取其 中單菌落進行常規(guī)純化培養(yǎng)；
[0013] 2)將純化菌液接種于小麥培養(yǎng)基中，按照37°C，46°C，55°C的溫度梯度培養(yǎng)6d;其 中，37°C培養(yǎng)2天，46°C培養(yǎng)2天，55°C培養(yǎng)2天；
[0014] 3)從步驟2)培養(yǎng)得到的混合菌株中篩選出產醬香香味物質較多的枯草芽抱桿菌、 地衣芽抱桿菌。
[0015] 其中，所述PDA培養(yǎng)基配制方法為：稱取200g馬鈴馨，洗凈去皮切碎，加 lOOOmL d地2〇煮沸30min，四層紗布過濾，加20g葡萄糖，15-20g瓊脂，充分溶解，121°C滅菌30min后 倒平板，冷卻備用。
[0016] 所述小麥培養(yǎng)基配方為:將小麥破碎成麥粒和麥粉各半共lOOg，加50 %水，121°C 滅菌30min，冷卻打散備用。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述復合菌劑的制備方法，將枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、解淀 粉酶芽抱桿菌分別接種于PDA培養(yǎng)基中，于36-37°C培養(yǎng)22-24h，收集菌液，按比例混合即 可。
[0018] 本發(fā)明還提供上述復合菌劑在煙葉醇化發(fā)酵過程中的應用。
[0019] 本發(fā)明還提供一種煙葉醇化處理方法，將復合菌劑噴灑于煙葉表面進行醇化發(fā)酵 處理。其中，噴灑量為1%，即ImL菌液/kg煙葉；醇化發(fā)酵條件為:溫度38-40°C，時間23-25 天。
[0020] 本發(fā)明將茅臺酒致香微生物的功能開發(fā)與提高煙草質量聯(lián)系起來，首次將茅臺酒 曲微生物發(fā)酵產物應用于煙葉發(fā)酵中，通過運些致香微生物的活動或其代謝產物的添加， 可增加煙葉發(fā)酵中優(yōu)質微生物的種類，增加香味物質的種類，起到類似添加茅臺酒增香的 效果，從而提高煙葉醇化質量。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為不同發(fā)酵時間致香物質總量圖。
[0022] 圖2為不同發(fā)酵時間新植二締含量圖。
[0023] 圖3為不同發(fā)酵時間巨豆Ξ締酬含量圖。
[0024] 圖4為不同發(fā)酵時間二氨雜猴桃內醋含量圖。
[0025] 圖5為不同發(fā)酵時間茄酬含量圖。
[0026] 圖6為不同發(fā)酵時間β-胡蘿h素降解產物含量圖。
[0027] 圖7為不同發(fā)酵時間葉黃素降解產物含量圖。
[0028] 圖8為不同發(fā)酵時間揮發(fā)性酬類含量圖。
[0029] 圖9為不同發(fā)酵時間半揮發(fā)性酬類含量圖。
[0030] 圖10為不同發(fā)酵時間揮發(fā)性醒類含量圖。
[0031] 圖11為不同發(fā)酵時間直鏈脂肪酸醋類含量圖。
[0032] 圖12為不同發(fā)酵時間雜環(huán)類含量圖。
[0033] 圖13為不同發(fā)酵時間揮發(fā)性醇類含量圖。
[0034] 圖14為不同發(fā)酵時間直鏈脂肪酸含量圖。
【具體實施方式】
[0035] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0036] 實施例1復合菌劑的制備
[0037] 1.1培養(yǎng)基的制備
[003引 1)PDA液體培養(yǎng)基的制備：即稱取200g馬鈴馨，洗凈去皮切碎，加水lOOOmL d地20 煮沸30min，四層紗布過濾，加20g葡萄糖，充分溶解，121°C滅菌30min冷卻備用。
[0039] 2)小麥培養(yǎng)基的制備:將小麥破碎成麥粒和麥粉各半共lOOg，加50%水，121°C滅 菌30min，冷卻打散備用。
[0040] 1.2復合菌劑的制備
[0041] 1)枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌的分離
[0042] 將茅臺酒曲黑色部分接種于PDA平板培養(yǎng)基中，于50°C培養(yǎng)2地，挑取其中單菌落 進行純化培養(yǎng)，將由此分離的純化菌株菌液加入小麥培養(yǎng)基中，按照37°C，46°C，55°C的溫 度梯度培養(yǎng)6d，其中，37°C培養(yǎng)2天，46°C培養(yǎng)2天，55°C培養(yǎng)2天;從培養(yǎng)得到的混合菌株中 篩選出產生較多醬香香味物質的菌株(即枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌)作為產香菌株。
[0043] 其中，所述枯草芽抱桿菌的保藏菌號：CCTCC Μ 2015575,所述地衣芽抱桿菌的保 藏菌號：CCTCC Μ 2015576。
[0044] 2)復合菌劑的制備
[0045] 將枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌和解淀粉酶芽抱桿菌分別接種于PDA培養(yǎng)基中，于 37°C培養(yǎng)2地，收集菌液，再按活菌數(shù)109cf u/ml、109cf u/ml、109cf u/ml混合，即得復合菌劑。
[0046] 實施例2煙葉的醇化發(fā)酵處理
[0047] 選取貴州省駭西南地區(qū)A3C2(中部葉)進行試驗，先采用同時蒸饋萃取法對煙葉預 處理，將上述實施例1制得的復合菌劑W接種量l%(lmL菌液/kg煙葉）噴灑于煙葉上，在溫 度4