一種固定化葡萄糖氧化酶及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化酶技術領域，具體涉及一種固定化葡萄糖氧化酶及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]傳統(tǒng)意義上固定化是指釆用物理或化學的方法將酶在空間上限制在一些水不溶性的載體周圍，限制其自由活動但是不影響生物催化劑的活性。傳統(tǒng)的固定化技術主要分為四種:吸附法、包埋法、共價結合法、交聯(lián)法。通常吸附法和包埋法的固定化效率(小于40%)和酶活回收率較低(小于20%)，交聯(lián)法由于要加入交聯(lián)劑，酶活的損失比較大。隨著生物技術和材料科技的進步，固定化技術正面臨著一個非常重要的轉(zhuǎn)型。越來越多的新型材料用于酶的固定化，尤其是納米材料以其獨特的理化特性在固定化領域有著越來越重要的應用。傳統(tǒng)的多孔材料無法進一步提高其負載量，是因為增加載體比表面積的同時不可避免的會減小微孔的直徑，從而降低其負載能力。而納米材料具有很大的比表面積，因此具有很好的負載能力。然而，這些載體的表面往往缺乏活潑的官能團不利于蛋白的結合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服現(xiàn)有技術的不足和缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，該方法以磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽為載體固定化葡萄糖氧化酶，具有固定化葡萄糖氧化酶固定化效率高，酶活回收率高，操作簡便，條件溫和等特點。
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的固定化葡萄糖氧化酶。
[0005]本發(fā)明的再一目的在于提供上述固定化葡萄糖氧化酶的應用。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn):
[0007]—種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，包含如下步驟:
[0008](I)將纖維素溶解于NaOH-Urea水溶液中，在攪拌條件下，加入納米Fe3O4,加水再生，產(chǎn)物分離并洗滌，得到磁性纖維素；
[0009](2)將步驟(I)制得的磁性纖維素與硝酸鋅溶液混合攪拌5?30min，得到混合溶液；
[0010](3)在步驟(2)制得的混合溶液中加入2-甲基咪唑溶液，攪拌反應0.5?24h;得到載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽；
[0011](4)將步驟(3)制得的載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽與葡萄糖氧化酶液混合，在O?25°C的溫度下固定化I?12h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
[0012]步驟(I)中所述的纖維素優(yōu)選為微晶纖維素；
[0013]步驟(I)中所述的納米Fe3(k的制備方法，包含如下步驟:
[0014]將FeCl3.6H2O和FeCl2.4出0溶解在水中，調(diào)節(jié)溶液pH為9?12;然后將混合溶液在30°C下反應0.5?3h，得到納米Fe3O4;制得的納米Fe3O4保存在Tris-HCl的緩沖溶液中；
[0015]所述的FeCl3.6出0和FeCl2.4出0的物質(zhì)的量比優(yōu)選為2:1;
[0016]所述的TriS-HCL的緩沖溶液pH優(yōu)選為7;
[0017]步驟(I)中所述的NaOH-Urea水溶液優(yōu)選為包含如下按質(zhì)量百分比計的組分:7%NaOH和12% Urea;
[0018]步驟(I)中所述的NaOH-Urea水溶液與纖維素的質(zhì)量比為1: (0.01?0.05);
[0019]步驟(I)中所述的溶解的溫度優(yōu)選為-12°C以下；
[0020]步驟(I)中所述的纖維素與納米Fe3O4的質(zhì)量比為1:(0.1?3);
[0021]步驟(2)中所述的硝酸鋅溶液中的硝酸鋅與磁性纖維素的質(zhì)量比為1:(0.5?2);
[0022]步驟(3)中所述的2-甲基咪唑溶液中的2-甲基咪唑與步驟(2)中硝酸鋅溶液中的硝酸鋅的摩爾比優(yōu)選為4:1 ；
[0023 ] 步驟(2)、( 3)中所述的攪拌速率為100?500rpm ；
[0024]步驟(4)中所述的固定化葡萄糖氧化酶中，葡萄糖氧化酶的負載量為20mg/g?300mg/g磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽；
[0025]—種固定化葡萄糖氧化酶通過上述制備方法制備得到；
[0026]所述的固定化葡萄糖氧化酶在酶制劑領域中的應用；
[0027]本發(fā)明的原理:金屬-有機骨架(MOF)材料，是基于有機配體與金屬離子間的金屬-配體絡合作用，通過自組裝而形成的一類超分子微孔網(wǎng)絡結構材料。利用MOF材料的多空結構可以很好地固定化酶，而將固定化酶重復利用傳統(tǒng)的方法是利用離心的手段進行分離，而此方法不利于固定化酶的重復利用并且會對酶活造成一定的損失。針對這一問題，本發(fā)明將纖維素在_12°C下溶解在NaOH/Urea溶液中，同時引入納米四氧化三鐵，然后加水再生破壞了溶劑與纖維素之間的氫鍵，當溶劑慢慢與水混合之后，纖維素自身又開始以氫鍵的方式重新形成結晶體結構，慢慢從混合溶液中析出，在磁場作用下產(chǎn)物可與液相快速分離，進而得到磁性纖維素微球(RCM)；磁性纖維素納米晶為基材，通過合成ZIF-8進行表面改性，獲得載體;然后將酶通過嵌入方式固定在載體上，從而得到固定化的酶制劑。
[0028]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點:
[0029](I)本發(fā)明在固定化酶過程中不使用戊二醛、甲醛等雙功能試劑，成本較低，反應溫和，能夠較大程度保地持酶活(78.6 %?90 % )，提高酶活回收率。
[0030](2)本發(fā)明所制備的材料能夠用作固定化酶的載體，能夠固定化脂肪酶、蛋白酶、過氧化物酶等一系列酶。并具有作為蛋白質(zhì)藥物載體的潛質(zhì)。
【附圖說明】
[0031]圖1是實施例1?3制備得到的磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽的紅外光譜圖；其中，(a):實施例1; (b):實施例2; (c):實施例3。
[0032]圖2是實施例1?5制備得到的磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽的X-射線衍射圖:其中，(a):實施例1; (b):實施例2; (C):實施例3; (d):實施例4; (e):實施例5。
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0034]實施例中葡萄糖氧化酶粗酶粉購自試劑公司；
[0035]實施例1
[0036](I)稱取2.43g FeCl3.6H2O和0.9g FeCl2.4H20溶解在300mL蒸餾水中，向溶液中滴加氨水，調(diào)節(jié)溶液pH為10，將混合溶液在30°C下反應lh，得到納米Fe3O4;制得的納米Fe3O4可保存在pH=7的Tr i s-HCl的緩沖溶液中；
[0037](2)稱取1mg微晶纖維素，_12°C條件下溶解在含有質(zhì)量百分比為7%Na0H與12%Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纖維素的質(zhì)量比是1: 0.02;在磁力攪拌條件下加入5mg的Fe3O4,然后向混合溶液中加水使纖維素再生，用磁鐵將其分離，并用蒸餾水洗滌三次，得到磁性纖維素納米晶；
[0038](3)取23.799mg六水合硝酸鋅溶解在2mL蒸餾水中，與15mg步驟(I)制得的磁性纖維素納米晶混合攪拌20min，攪拌速度為10rpm，得到混合溶液；
[0039](4)將26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸餾水中，然后加入步驟(3)制得的混合溶液中，攪拌條件(攪拌速度為10rpm)下反應30min，得到載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽；
[0040](5)將葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，過濾除去不溶性雜質(zhì)，取0.1mL酶液(酶含量Img)與步驟(3)制得的載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽混合，25°C攪拌條件下進行固定化12h，然后用蒸餾水洗滌未固定化到載體上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
[0041 ]本實施例固定化酶效率為92.4%,酶活回收率為78.6 %，制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的負載量為26.5mg酶/g載體。
[0042]實施例2
[0043](I)稱取2.43g FeCl3.6H2O和0.9g FeCl2.4H20溶解在300mL蒸餾水中，向溶液中滴加氨水，調(diào)節(jié)溶液pH為10，將混合溶液在30°C下反應lh，得到納米Fe3O4;制得的納米Fe3O4可保存在pH=7的Tris-HCl的緩沖溶液中；
[0044](2)稱取1mg微晶纖維素，_12°C條件下溶解在含有質(zhì)量百分比為7%Na0H與12%Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纖維素的質(zhì)量比是1: 0.02，在磁力攪拌條件下加入1mg的Fe3O4,然后向混合溶液中加水使纖維素再生，用磁鐵將其分離，并用蒸餾水洗滌三次，得到磁性纖維素納米晶；
[0045](3)取23.799mg六水合硝酸鋅溶解在2mL蒸餾水中，與20mg步驟(I)制得的磁性纖維素納米晶混合攪拌20min，攪拌速度為300rpm，得到混合溶液；
[0046](4)將26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸餾水中，然后加入步驟(3)制得的混合溶液中，攪拌條件(攪拌速度為300rpm)下反應12h，得到載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽；
[0047](5)將葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，過濾除去不溶性雜質(zhì)，取0.6mL酶液(酶含量6mg)與步驟(3)制得的載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽混合，0°C條件攪拌下進行固定化12h，用蒸餾水洗滌未固定化到載體上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
[0048]本實施例固定化酶效率為87.3%,酶活回