收率為84.2%,制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的負載量為121.7mg酶/g載體。
[0049]實施例3
[0050](I)稱取2.43g FeCl3.6H2O和0.9g FeCl2.4H20溶解在300mL蒸餾水中，向溶液中滴加氨水，調(diào)節(jié)溶液pH為10，將混合溶液在30°C下反應lh，得到納米Fe3O4;制得的納米Fe3O4可保存在pH=7的Tris-HCl的緩沖溶液中；
[0051](2)稱取1mg微晶纖維素，-12°C條件下溶解在含有質(zhì)量百分比為7%Na0H與12%Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纖維素的質(zhì)量比是1: 0.02，在磁力攪拌條件下加入15mg的Fe3O4,然后向混合溶液中加水使纖維素再生，用磁鐵將其分離，并用蒸餾水洗滌三次，得到磁性纖維素納米晶；
[0052](3)取23.799mg六水合硝酸鋅溶解在2mL蒸餾水中，與25mg步驟(I)制得的磁性纖維素納米晶混合攪拌20min，攪拌速度為500rpm，得到混合溶液；
[0053](4)將26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸餾水中，然后加入步驟(3)制得的混合溶液中，攪拌條件(攪拌速度為300rpm)下反應24h，得到載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽；
[0054](5)將葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，過濾除去不溶性雜質(zhì)，取ImL酶液(酶含量1mg)與步驟(3)制得的載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽混合，25°C攪拌條件下進行固定化3h，用蒸餾水洗滌未固定化到載體上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
[0055]本實施例固定化酶效率為89.5%,酶活回收率為83.6%，制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的負載量為247.6mg酶/g載體。
[0056]實施例4
[0057](I)稱取2.43g FeCl3.6H2O和0.9g FeCl2.4H20溶解在300mL蒸餾水中，向溶液中滴加氨水，調(diào)節(jié)溶液pH為10，將混合溶液在30°C下反應lh，得到納米Fe3O4;制得的納米Fe3O4可保存在pH=7的Tris-HCl的緩沖溶液中；
[0058](2)稱取1mg微晶纖維素，_12°C條件下溶解在含有質(zhì)量百分比為7%Na0H與12%Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纖維素的質(zhì)量比是1: 0.05;在磁力攪拌條件下加入20mg的Fe3O4,然后向混合溶液中加水使纖維素再生，用磁鐵將其分離，并用蒸餾水洗滌三次，得到磁性纖維素納米晶；
[0059](3)取23.799mg六水合硝酸鋅溶解在2mL蒸餾水中，與30mg步驟(I)制得的磁性纖維素納米晶混合攪拌20min，攪拌速度為300rpm，得到混合溶液；
[0060](4)將26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸餾水中，加入步驟(3)制得的混合溶液中，攪拌條件(攪拌速度為300rpm)下反應Ih，得到載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽；
[0061](5)將葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，過濾除去不溶性雜質(zhì)，取ImL酶液(酶含量1mg)與步驟(3)制得的載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽混合，25°C攪拌條件下進行固定化6h，然后用蒸餾水洗滌未固定化到載體上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
[0062]本實施例固定化酶效率為92.6%,酶活回收率為79.4%,制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的負載量為286.7mg酶/g載體。
[0063]實施例5
[0064](I)稱取2.43g FeCl3.6H2O和0.9g FeCl2.4H20溶解在300mL蒸餾水中，向溶液中滴加氨水，調(diào)節(jié)溶液pH為10，將混合溶液在30°C下反應lh，得到納米Fe3O4;制得的納米Fe3O4可保存在pH=7的Tris-HCl的緩沖溶液中；
[0065](2)稱取1mg微晶纖維素，_12°C條件下溶解在含有質(zhì)量百分比為7%Na0H與12%Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纖維素的質(zhì)量比是1: 0.02;在磁力攪拌條件下加入30mg的Fe3O4,然后向混合溶液中加水使纖維素再生，用磁鐵將其分離，并用蒸餾水洗滌三次，得到磁性纖維素納米晶；
[0066](3)取23.799mg六水合硝酸鋅溶解在2mL蒸餾水中，與40mg步驟(I)制得的磁性纖維素納米晶混合攪拌20min，攪拌速度為10rpm，得到混合溶液；
[0067](4)將26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸餾水中，步驟(3)制得的混合溶液中，攪拌條件(攪拌速度為10rpm)下反應30min，得到載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽；
[0068](5)將葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，過濾除去不溶性雜質(zhì)，取ImL酶液(酶含量1mg)與步驟(3)制得的載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽混合，25°C攪拌條件下進行固定化應12h，用蒸餾水洗滌未固定化到載體上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
[0069]本實施例固定化酶效率為84.7%,酶活回收率為86.9%，制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的負載量為275.8mg酶/g載體。
[0070]效果實施例
[0071]對實施例1?5制得的磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽分別進行紅外光譜和X-射線衍射檢測;結(jié)果見圖1和圖2。
[0072]從圖1可以看出，實施例1?3制得的磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽在3440和3370cm—1處峰分別反映纖維素分子內(nèi)和分子間氫鍵的峰。594cm—1處有很強的吸收峰，是Fe304特征吸附峰。
[0073]從圖2可以看出，衍射角為12.4，20.2和22.2°的三個峰為再生纖維素衍射峰，在衍射角為30.24，35.60，43.24，和57.16°出現(xiàn)明顯的峰為Fe3O4的晶面衍射峰。并且隨著Fe3O4含量增多，其峰強度明顯增強。
[0074]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于包含如下步驟: (1)將纖維素溶解于NaOH-Urea水溶液中，在攪拌條件下，加入納米Fe304，加水再生，產(chǎn)物分離并洗滌，得到磁性纖維素； (2)將步驟(I)制得的磁性纖維素與硝酸鋅溶液混合攪拌5?30min，得到混合溶液； (3)在步驟(2)制得的混合溶液中加入2-甲基咪唑溶液，攪拌反應0.5?24h;得到載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽； (4)將步驟(3)制得的載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽與葡萄糖氧化酶液混合在O?25°C的溫度下固定化I?12h，得到固定化葡萄糖氧化酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的納米Fe304的制備方法，包含如下步驟: 將FeCl3.6H20和FeCl2.4H20溶解在水中，調(diào)節(jié)溶液pH為9?12;然后將混合溶液在30°C下反應0.5?3h，得到納米Fe3〇4。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于: 所述步驟(I)中NaOH-Urea水溶液為包含如下按質(zhì)量百分比計的組分:7%Na0H和12%Urea04.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的溶解的溫度為_12°C以下。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的纖維素與納米Fe3O4的質(zhì)量比為1:(0.1?3)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的硝酸鋅溶液中的硝酸鋅與磁性纖維素的質(zhì)量比為1:(0.5?2)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的2-甲基咪唑溶液中的2-甲基咪唑與步驟(2)中硝酸鋅溶液中的硝酸鋅的摩爾比為4:1。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的固定化葡萄糖氧化酶中，葡萄糖氧化酶的負載量為20mg/g?300mg/g磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽。9.一種固定化葡萄糖氧化酶，其特征在于:通過權(quán)利要求1?8任一項所述的制備方法制備得到。10.權(quán)利要求9所述的固定化葡萄糖氧化酶在酶制劑領域中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于固定化酶技術領域，具體涉及一種固定化葡萄糖氧化酶及其制備方法與應用。本發(fā)明將纖維素溶解于NaOH-Urea水溶液中，在攪拌條件下，加入納米Fe3O4，加水再生，產(chǎn)物分離并洗滌，得到磁性纖維素；將步磁性纖維素與硝酸鋅溶液混合攪拌5～30min，然后加入2-甲基咪唑溶液，攪拌反應0.5～24h；得到載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽；將載體磁性纖維素-二甲基咪唑鋅鹽與葡萄糖氧化酶液混合在0～25℃的溫度下固定化1～12h，得到固定化葡萄糖氧化酶；本發(fā)明不需要加交聯(lián)劑，固定化效率高，酶活回收率高，操作簡便，條件溫和等特點。
【IPC分類】C12N11/12, C12N11/14
【公開號】CN105543211
【申請?zhí)枴緾N201610111460
【發(fā)明人】婁文勇, 徐紅, 曹詩林, 宗敏華
【申請人】華南理工大學
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年2月29日