保存在-40°C低溫冰箱內(nèi)，對細(xì)胞（即P2代細(xì)胞)進(jìn)行傳代，再 W8000個/cm2密度接種到T225培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞生長到匯合度75~85%時，收集上清液并 保存在-40°C低溫冰箱內(nèi)，對細(xì)胞（即P3代細(xì)胞)進(jìn)行傳代，如此重復(fù)操作直到收獲P5代細(xì) 胞，按1.0~10.ΟΧΙΟ7個細(xì)胞/ml密度凍存(細(xì)胞凍存時加入10%的DMSO)，并對最后收集的 細(xì)胞上清液取樣，進(jìn)行無菌、支原體、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。
[0042] (5)將收集的P1-P5代細(xì)胞的所有無血清培養(yǎng)液在37°C解凍后合并在一起得到20L 液體。
[0043] 2、過濾濃縮
[0044] 對收集的無血清上清液先采用0.22μπι濾膜過濾，去除混在上清液中的細(xì)胞碎片； 再采用分級無菌超濾分離機(jī)進(jìn)行截留，此處所述分級超濾分離機(jī)，是由電磁供料累、耐震壓 力表、無菌原料罐、壓力表、無菌管道支架和1000D和50KD無菌有機(jī)濾膜等配件連接組成。
[0045] 培養(yǎng)上清液通過濾膜的順序為，先通過50KD有機(jī)濾膜，收集低于50KD的細(xì)胞因子 液;然后將細(xì)胞因子液用電磁累再次打入lOOOd有機(jī)濾膜，收集到1L-化細(xì)胞因子濃縮液，根 據(jù)工藝需要，通過反復(fù)濃縮可W將細(xì)胞因子體積濃縮為原培養(yǎng)上清液體積的1/10-1/150， 既可。
[0046] =、實驗結(jié)果
[0047] 1、人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)
[0048] 取P5代細(xì)胞懸液進(jìn)行流式檢測，檢測結(jié)果如表1，圖1所示。
[00例表1 P5代MSC細(xì)胞的免疫表型
[(K)加 ]
[0051] FITC:代表異硫氯酸巧光素標(biāo)記;PE:代表藻紅蛋白標(biāo)記。 '
[0化2]由表1，圖1所見，細(xì)胞高表達(dá)CD90、CD105,但不表達(dá)CD45、HLA-DR，符合人廝帶間充 質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志特征。
[0053] 2、細(xì)胞因子濃縮液中的細(xì)胞因子含量測定
[0054] 用化ISA試劑盒對表皮生長因子化GF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和血管內(nèi)皮細(xì) 胞生長因子(VEGF)為代表的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，試驗中對3根廝帶分別分離所得的培養(yǎng)上 清液、10根混合廝帶培養(yǎng)所得培養(yǎng)上清液進(jìn)行細(xì)胞因子含量測定。
[0055] 再對混合廝帶培養(yǎng)所得上清液采用3000D濾膜與采用1000D與50KD聯(lián)合超濾后進(jìn) 行含量比較，W及回收率檢測。
[0056] 試驗均取化細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用0.22μπι濾膜過濾后進(jìn)行超濾，直至濃縮液為250ml 為止取樣進(jìn)行含量的測定后比較。
[0化7] 檢測結(jié)果見表2。
[005引表2細(xì)胞因子含量對比 [0化9]
[0060] 由表2可見，與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明聯(lián)合濾膜超濾法得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的細(xì) 胞因子含量均較高，回收率高，尤其是EGF的回收率可從80.5%提高到91.5% ;FGF的回收率 可從87.9%提高到94.5%。
[0061] 廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子具有美容護(hù)膚功效，其回收率越高，美容護(hù)膚效果越好。本 發(fā)明方法可W顯著提高細(xì)胞因子的回收率，與現(xiàn)有方法相比，用于美容護(hù)膚優(yōu)勢明顯。
[0062] 而且發(fā)明中采用混合廝帶得到細(xì)胞培養(yǎng)上清液，所得到的培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子 量穩(wěn)定，利于工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量控制。
[0063] 實施例2本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞因子的制備
[0064] 1、取實施例1制備得到的細(xì)胞因子濃縮液，通過反復(fù)超濾調(diào)整細(xì)胞因子濃縮液濃 度，使?jié)饪s液中EGF含量為0.4ug/ml。
[0065] 2、在細(xì)胞因子濃縮液中加入一定量的凍干保護(hù)劑，使EGF的含量為0.3ug/ml，并調(diào) 節(jié)抑值為6.0。
[0066] 其中，凍干保護(hù)劑每100ml中含有如下組分:抗壞血酸(VC)0.5g，人白蛋白0.5ml， 右旋糖巧3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、巧樣酸鋼0.26g、叔下 醇15ml。
[0067] 凍干條件為:溫度在-25~-40°C，壓強(qiáng)維持在10-3化a，時間為16-24h，得到細(xì)胞因 子凍干粉。
[0068] 3、細(xì)胞因子凍干粉的活性測定
[0069] 采用EGF ELISA試劑盒測定，EGF的活性為95%。
[0070] 細(xì)胞因子凍干粉水分經(jīng)測定小于1.5%。
[0071] 本發(fā)明的凍干保護(hù)劑可W有效保護(hù)細(xì)胞因子的活性，而且凍干時間短，生產(chǎn)效率 較高。
[0072] 實施例3本發(fā)明細(xì)胞因子化妝品或藥物的制備
[0073] 取實施例2制備的細(xì)胞因子凍干粉，加入透明質(zhì)酸、膠原蛋白、無菌超純水制成組 合物，該組合物可W加入到常規(guī)護(hù)膚品中，也可單獨作為護(hù)膚品使用。
[0074] 其中100ml水溶液中含細(xì)胞因子凍干粉l.Og，低分子量（3000D-10KD)透明質(zhì)酸 0.5g，膠原蛋白無菌溶液2ml，水溶性氮酬5g。
[0075] 實施例4本發(fā)明細(xì)胞因子化妝品或藥物的制備
[0076] 取實施例2制備的細(xì)胞因子凍干粉，加入透明質(zhì)酸、膠原蛋白、無菌超純水制成組 合物。
[0077] 其中10ml水溶液中含細(xì)胞因子凍干粉O.lg，低分子量（3000D-10KD)透明質(zhì)酸 0.05g，膠原蛋白無菌溶液0.2ml。
[0078] 實施例5本發(fā)明細(xì)胞因子化妝品或藥物的制備
[0079] 取實施例2制備的細(xì)胞因子凍干粉，加入透明質(zhì)酸、膠原蛋白、無菌超純水制成組 合物。
[0080] 其中10ml水溶液中含細(xì)胞因子凍干粉0.05g，低分子量（3000D-10KD)透明質(zhì)酸 0.01 g，膠原蛋白無菌溶液0.5ml。
[0081] 實施例6本發(fā)明細(xì)胞因子化妝品或藥物的制備
[0082] 取實施例2制備的細(xì)胞因子凍干粉，加入透明質(zhì)酸、膠原蛋白、無菌超純水制成組 合物。
[0083] 其中10ml水溶液中含細(xì)胞因子凍干粉0.15g，低分子量（3000D-10KD)透明質(zhì)酸 0.1 g，膠原蛋白無菌溶液0.1ml。
[0084] W下通過試驗例具體說明本發(fā)明的有益效果。
[0085] 試驗例1本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞因子的凍干保護(hù)劑篩選 [00化]一、試驗方法
[0087] 1、取實施例1制備得到的細(xì)胞因子濃縮液，通過超濾調(diào)整濃度，使?jié)饪s液中EGF含 量為 0.4ug/ml。
[00則 2、在細(xì)胞因子濃縮液中加入一定量的凍干保護(hù)劑，使EGF的含量為0.3ug/ml，并調(diào) 節(jié)pH值為6.0。凍干保護(hù)劑配方分別如下所示：
[0089] 配方1:100ml中含有如下組分:抗壞血酸0.5g，人白蛋白0.5ml，右旋糖巧3.5g、海 藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、巧樣酸鋼0.26g、叔下醇15ml。
[0090] 配方2:100ml中含有如下組分：抗壞血酸（VC)0.5g，人白蛋白0.5ml，右旋糖巧 3.5邑、海藻糖1.5肖，甘氨酸0.04肖、精氨酸0.17肖、氨基乙酸2肖、巧樣酸鋼0.26邑。
[0091] 3、在壓強(qiáng)為10~30pa，-25~-40°c下進(jìn)行凍干。
[0092] 二、試驗結(jié)果
[0093] 見表 3。
[0094] 表3兩種凍干保護(hù)劑比較
[0095]
[0096] ~由表3可見，使用本發(fā)明凍干保護(hù)劑配方（配方1)可W顯著降低凍干所需要的時' 間，而且凍干粉中水分含量低，使凍干粉更易于保存。
[0097] 因此，本發(fā)明的凍干保護(hù)劑用于凍干時效果好，具有顯著優(yōu)勢。
[0098] 試驗例2本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞因子的應(yīng)用
[0099] -、方法
[0100] 選取體重2公斤左右日本大耳白兔30只，雌雄各半。經(jīng)脫毛、局麻后，用波長1064nm 激光、光斑直徑3mm、能量密度12J/cm2、光皮距離7cm、時間30秒照射家兔背部，造成深達(dá)真 皮的損傷。然后將家兔分為5組，每組6只。
[0101 ]第1組為模型對照組：只照激光不加藥處理；
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