102] 第2組為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)陽(yáng)性對(duì)照組:將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)
[0103] 因子均勻噴于創(chuàng)面，用量為85IU/cm^d，每日處理一次；
[0104] 第3組為護(hù)膚品涂抹組:涂抹實(shí)施例3方法制備的護(hù)膚品16mg/cmVd，
[01化]每日處理一次；
[0106] 第4組為微針注射液組:微針注射實(shí)施例4方法制備的組合物20化/cmVd，每日處 理一次；
[0107] 第5組為空白對(duì)照組，不照激光不加藥處理。
[0108] 在第3、6、9、12天，肉眼觀察創(chuàng)面脫挪時(shí)間和愈合時(shí)間，取皮膚組織做病理皿染色， 并在W上各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)白介素6(化-6)、腫瘤壞死因子(TNF-a)、班巧酸脫氨酶(SDH)和翔捕 氨酸化YP)。
[0109] 二、結(jié)果
[0110] 見(jiàn)表 4-9 和圖 2-5。
[0111] 表4各組脫挪時(shí)間比較(天）
[0112]
[0113] ~與模型對(duì)照組相比，吁<0.01。
[0114] 由表4可見(jiàn)，與模型對(duì)照組相比，處理組2-4組的脫挪時(shí)間均顯著降低(p<0.01)，其 中含有間充質(zhì)干細(xì)胞因子的受試組(第3組和第4組）與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子陽(yáng)性對(duì)照組沒(méi) 有顯著性差異(P〉〇.05)，脫挪效果相當(dāng)。
[0115] 因此，使用本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞因子可W顯著促進(jìn)受損皮膚的脫挪修復(fù)。
[0116] 表5各組愈合時(shí)間比較(天）
[0117]
[011引與模型對(duì)照組相比，啼<0.01。
[0119]由表5可見(jiàn)，與模型對(duì)照組相比，處理組2-4組的愈合時(shí)間均顯著降低(p<0.01);其 中含有間充質(zhì)干細(xì)胞因子的受試組(第3組和第4組）與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子陽(yáng)性對(duì)照組沒(méi) 有顯著性差異(P〉〇.〇5)，愈合時(shí)間相當(dāng)（P〉0.05)。
[0120] 因此，使用本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞因子可W顯著促進(jìn)受損皮膚的愈合。
[0121] 表6各組白介素比-6濃度比較(ng/ml)
[0122] L0123J 與模型對(duì)照組相比，叮<0.01。
[0124] 表7各組TNF-a積分光密度比較（X 108)
[0125]
[0126] ~與模型對(duì)照組相比，啼<0.05/啼<0.01 與凍干細(xì)胞因子護(hù)膚品涂抹組相比，#P<| 0.01。
[0127] 表8各組S的1比活性比較化/mg蛋白）
[012 引
[0129] ~與模型對(duì)照組相比，啼<0.01。
' ' '
[0130] 表9各組HYP濃度比較(yg/mg)
[0131] _^
^^^
[0132] 與模型對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。
[0133] 由表6-9可見(jiàn)，
[0134] 與模型對(duì)照組相比，處理組2-4組的IL-6含量均顯著降低(p<0.01)，其中含有間充 質(zhì)干細(xì)胞因子的受試組(第3組和第4組)與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組、空白對(duì)照組的IL-6含量 相當(dāng)。
[0135] 處理組2-4組的TNF-a含量均顯著提高(p<〇. 01)，其中第4組(微針注射液組）與成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組、空白對(duì)照組的TNF-a含量相當(dāng)，均高于凍干因子護(hù)膚品涂抹組。
[0136] 處理組2-4組的SM1含量均顯著提高(p<0.01)，其中含有間充質(zhì)干細(xì)胞因子的受試 組(第3組和第4組)與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組的SDH含量相當(dāng)。
[0137] 處理組2-4組的HYP含量均顯著提高(p<0.05)，其中第4組(微針注射液組）與成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組、空白對(duì)照組的HYP含量相當(dāng)，均高于凍干因子護(hù)膚品涂抹組。
[0138] 因此，本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞因子能夠促進(jìn)TNF-a的合成和釋放，減少I(mǎi)L-6的分 泌，減輕局部創(chuàng)面炎癥反應(yīng);提高創(chuàng)面細(xì)胞SDH活性，加快HYP合成，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本發(fā) 明的間充質(zhì)干細(xì)胞因子可W顯著修復(fù)皮膚損傷。
[0139] 綜上，本發(fā)明方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞因子，細(xì)胞因子回收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，修復(fù) 皮膚損傷效果好;而且本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行、適合大規(guī)模生產(chǎn)，具有良好的市場(chǎng)前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子的方法，其特征在于:它包括如下步驟： a、 細(xì)胞培養(yǎng)上清液的獲取:取人間充質(zhì)干細(xì)胞，置于間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到匯合度75~85 %時(shí)，收集上清液； b、 過(guò)濾濃縮:對(duì)步驟a的上清液先采用0.22μπι濾膜過(guò)濾；然后通過(guò)50KD超濾膜，收集透 析液，再將透析液通過(guò)1KD超濾膜，收集截留液，得到細(xì)胞因子濃縮液，即可。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 步驟a中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法為：取臍帶，在無(wú)菌條件下，采用組織塊法培養(yǎng)得 到;所述取臍帶為取5-10根臍帶混合。3. 權(quán)利要求1或2所述方法制備得到的細(xì)胞因子濃縮液。4. 一種人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉的制備方法，其特征在于:步驟如下：取權(quán)利要求 3所述的細(xì)胞因子濃縮液，凍干，得人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于： 凍干前，先加入凍干保護(hù)劑;其中，所述凍干保護(hù)劑每l〇〇ml中含有如下組分:抗壞血酸 0.3~0.8區(qū)，人白蛋白0.1~11111，右旋糖苷2.5~4.(^、海藻糖1~2區(qū)，甘氨酸0.02~0.08區(qū)、精 氨酸0.05~0.17g、氨基乙酸2g、梓檬酸鈉0.26g、叔丁醇10~20ml; 進(jìn)一步地，所述凍干保護(hù)劑每100ml中含有如下組分:抗壞血酸0.5g，人白蛋白0.5ml， 右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、檸檬酸鈉0.26g、叔丁 醇15ml; 所述凍干的條件為:壓強(qiáng)為10~30pa，_25~_40°C下，16~24h。6. 權(quán)利要求5所述方法制備得到的人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉。7. 權(quán)利要求3所述細(xì)胞因子濃縮液或權(quán)利要求6所述細(xì)胞因子凍干粉在制備化妝品中 的用途。8. 權(quán)利要求3所述細(xì)胞因子濃縮液或權(quán)利要求6所述細(xì)胞因子凍干粉在制備修復(fù)皮膚 損傷的藥物中的用途。9. 一種細(xì)胞因子化妝品或藥物，其特征在于:每100ml中化妝品或藥物中包含權(quán)利要求 6所述的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉0.5~1.5g，透明質(zhì)酸0.1~lg，膠原蛋白1~5ml。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的化妝品或藥物，其特征在于:每100ml中化妝品或藥物中包含 間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉lg，透明質(zhì)酸〇.5g，膠原蛋白2ml;所述透明質(zhì)酸為分子量為 3000D-10KD的透明質(zhì)酸。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分離純化人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子的方法，它包括如下步驟：a、細(xì)胞培養(yǎng)上清液的獲?。喝∪碎g充質(zhì)干細(xì)胞，置于間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到匯合度75～85％時(shí)，收集上清液；b、過(guò)濾濃縮：對(duì)步驟a的上清液先采用0.22μm濾膜過(guò)濾；然后通過(guò)50KD超濾膜，收集透析液，再將透析液通過(guò)1KD超濾膜，收集截留液，得到細(xì)胞因子濃縮液,即可。本發(fā)明還提供了制備的間充質(zhì)干細(xì)胞因子及其用途。本發(fā)明還提供了一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞因子的化妝品。本發(fā)明方法可以有效去除間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中的雜質(zhì)，而且得到的細(xì)胞因子純度高，且產(chǎn)量也高，應(yīng)用前景良好。
【IPC分類】C12P21/02, A61K38/18, A61P17/00, A61K8/64, A61Q19/00, A61K8/98, C07K14/475, A61Q19/08, A61P17/02, C07K1/34, A61K35/28
【公開(kāi)號(hào)】CN105543313
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511016742
【發(fā)明人】任瑩瑩, 金百華, 何進(jìn)瓊, 王榮, 鄧云濤
【申請(qǐng)人】四川新生命干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年12月29日