大于98Ha，25(0H)2D3購于英國普利茅斯生物研究實驗室。a-MEM培養(yǎng)基購于美國GIBCOBRL。Soluble RANKL購于英國Peprotec Science。抗酒石酸酸性 磷酸酶(TRAP)試劑盒購于美國Sigma公司。葡聚糖凝膠購于上海如吉科技發(fā)展有限公司。標 準胎牛血清購于山東銀香偉業(yè)生物有限公司。注射用青霉素鈉購于華北制藥有限公司。注 射用硫酸鏈霉素購于深圳華藥南方制藥有限公司。丙酮、甲醛溶液購于石家莊市有機化工 廠。異氟烷購于魯南貝特制藥有限公司。二甲基亞砜購于天津市光復精細化工研究所。 [0029] BB5060/BB16二氧化碳培養(yǎng)箱（上海Heraeus公司），VD_650型桌上式細胞培養(yǎng)超凈 操作臺（蘇州凈化設備有限公司），BFX5-320型低速離心機（中國上海瀘南科學儀器聯(lián)營 廠），XD-1019810倒置顯微鏡(江南公司），CX-21光學顯微鏡（日本OLYMPUS)，微量加樣器(法 國611^(^)，2510型變頻振蕩儀(上海新波生物技術(shù)有限公司），6?-300型電子天(加?&1^&0 Company，limited)，725型超低溫冰箱(Forma Scientific · Inc)。未提到的材料和儀器均為 常規(guī)儀器。未提到的溶液配制均采用本領域常規(guī)溶液配制方法配制即可。
[0030]藥液配制及葡聚糖凝膠柱的制備：
[0031 ] 1、α-ΜΕΜ培養(yǎng)液的制備：
[0032] (Ι)α-ΜΕΜ粉一袋+超純水800ml，完全溶解；
[0033] (2)加碳酸氫鈉3.02g待完全溶解后加鹽酸測PH達7.2;
[0034] (3)再次加超純凈水至1000ml;
[0035] (4)加抗生素(青霉素及鏈霉素）；
[0036] (5)濾過滅菌(0 · 22微米微孔濾膜過濾）
[0037] (6)500ml滅菌瓶分裝，4°C儲藏備用。
[0038] 2、la，25(0H)2D3 儲存液的分裝
[0039] (1)取la，25(0H)2D3原液50微升（50微升一支），加入無水乙醇1150微升，使總量至 1200微升（即24倍稀釋）
[0040] (2)以100微升/只分裝于12支滅菌試管內(nèi)，-30 °C冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆茫?br>[0041 ] (3)應用前再次稀釋1000倍，使最終濃度為1 X 10-8M。
[0042] 3、Soluble RANKL儲存液分裝
[0043] (1)取1^疆17東干粉一支（10微克）；
[0044] (2)0.1M tris-HCl buffer 5〇微升溶解RANKL;
[0045] (3)以5微升/只分裝于10支滅菌冷凍管內(nèi)，_30°C冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆茫?br>[0046] (4)使用前取出一支，先用含10%FBSa-MEM培養(yǎng)液495微升溶解（即稀釋100倍）；添 加前再次稀釋100倍，使終濃度為20ng/ml。
[0047] 4、0· 1M tris-HCl buffer的制備
[0048] (l)tris-HCl 12.llg(0.1M)；
[0049] (2)超純水800ml (添加溶解后，調(diào)節(jié)pH至8.2);
[0050] (3)加超純水至1000ml備用。
[0051] 5、化合物(I)儲存液的制備
[0052] (1)儲存液的濃度：lmg/ml及 100ug/ml。
[0053] (2)儲存液的配制：稱取化合物（I)lmg放于滅菌冷凍管內(nèi)，加入二甲基亞砜lml完 全溶解，配成lmg/ml的儲存液。從lmg/ml的儲存液中取出100微升放于另一支滅菌冷凍管 內(nèi)，加入二甲基亞砜900微升即配成100微克/毫升的儲存液，儲存于4°C恒溫冰箱，使用時間 不超過兩周。lmg/ml的儲存液冷凍保存。
[0054] 6、TRAP固定液的制備
[0055] 在染色之前，按產(chǎn)品說明書配制。首先取無菌20ml試管一支，按以下順序依次加入 試劑:丙酮6.5ml、枸橡酸2.5ml、甲醛0.8ml，充分混勾，計9.8ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0056] 7、TRAP染色液的制備
[0057] 同樣是在染色之前配制，按產(chǎn)品說明制備，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0058] 8、葡聚糖凝膠柱的制備
[0059] (1)消毒后50ml注射器一個，除去內(nèi)芯；
[0060] (2)注射筒與注射頭交接處置消毒后的脫脂棉球一個；
[0061] (3)固定架固定針筒，針頭處接關閉狀的三通；
[0062] (4)將滅菌的葡聚糖凝膠混勻，抽取30ml注入針筒內(nèi)，打開三通，緩慢過濾沉淀，待 凝膠沉淀液面至15ml時為止;關閉三通，放入4°C恒溫冰箱過夜；
[0063] (5)實驗前1小時用含有15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液50ml緩慢注入凝膠柱內(nèi)，打 開三通，自然過濾洗滌凝膠柱后待用。
[0064]二、試驗方法 [0065] 1、全骨髓細胞培養(yǎng)
[0066] 1.1全骨髓細胞提取
[0067]實驗開始前30分鐘將標準胎牛血清放入37°C水浴箱內(nèi)解凍;取50mL無菌離心管一 個，裝入40mL不含胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液，以備沖洗全骨髓細胞用。
[0068] (1)選4周齡SD雄性大鼠1只，75 %乙醇消毒后，采用異氟烷吸入麻醉；（2)待麻醉起 效后，無菌條件下取大鼠兩側(cè)脛骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔；（3)用10mL注射器抽取 不含血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液，換用25號針頭后自骨髓腔內(nèi)沖出骨髓細胞至50mL無菌離心管內(nèi)； (4)將所提取的細胞懸液充分吹打，待沒有團塊后，將盛有細胞的離心管與平衡管一起放入 離心機內(nèi)離心，調(diào)整轉(zhuǎn)速(2000轉(zhuǎn)/分），離心5分鐘;離心過程中配制含有15%胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液50mL(7.5mL胎牛血清加入42.5mLa-MEM培養(yǎng)液中）備用；（5)離心結(jié)束后棄去上清 液，加入含15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液20mL，充分吹打混勻，形成細胞懸液，此液簡稱為細 胞原液。
[0069] 1.2細胞數(shù)的計算(原液濃度及稀釋倍數(shù)）
[0070] (1)取以上提取的細胞懸液25yL放入試管內(nèi)，然后加入5%醋酸475yL，即形成20倍 稀釋的細胞懸液;將試管放在振蕩器上，振蕩20秒鐘，目的是去除紅細胞；（2)計算細胞數(shù)： 取振蕩后細胞懸液滴入細胞計數(shù)盤，勿超過邊緣，蓋玻片覆蓋，倒置顯微鏡下計算細胞數(shù)， 計數(shù)盤4個大格內(nèi)所有細胞均計入。本實驗計算細胞數(shù)為537個，根據(jù)公式(細胞數(shù)/4) X20 \104〇6 118/11^推算細胞原液的濃度，本實驗計算如下（537/4)\20\ 104 = 26.85 \ 106cellS/mL即本實驗細胞原液濃度為26.85\106(^11 8/11^，而我們需要的目的濃度是2\ 106cellS/mL，所以細胞原液需要稀釋。（3)稀釋倍數(shù)計算如下:稀釋倍數(shù)=原液濃度/目的 濃度;本實驗稀釋倍數(shù)=26.85 X 106cells/mL/2 X 106cells/mL= 13.425，即原液需要稀釋 13.425倍才能達到需要的目的濃度。本實驗需要2\10%118/1^的細胞懸液4〇1!^，簡稱為 目的量。（4)達到目的濃度所需原液的量，計算如下:達到目的濃度所需原液的量=目的量/ 稀釋倍數(shù)。本實驗計算如下：達到目的濃度所需原液的量= 40mL/13.425 = 2.98mL。即取 26 · 85 X 106cells/mL的細胞原液2 · 98mL放入滅菌的50mL離心管內(nèi)，然后加入37 · 02mL(40-2.98)含15%胎牛血清的€1-|^培養(yǎng)液即可配成2\106〇6118/1^的細胞懸液4〇1^，然后加入 la，25 (OH)2D3儲存液40yL，操作過程應避光，即la，25(OH)2D 3終濃度為1 X 10-8M;再加入4yL soluble RANKL儲存液，即soluble RANKL終濃度為20ng/mL;加液過程在超凈工作臺上操 作，至此，所需2 X 106cel ls/mL的細胞懸液目的量配置完成。
[0071] 1.3培養(yǎng)細胞、加藥
[0072] (1)細胞接種：取4行6列24孔培養(yǎng)板一塊，每孔加入2X106cellS/mL的細胞懸液 O.SmLaxiOkellshU)加入化合物（I):取100yg/mL化合物（I)分裝液一支于培養(yǎng)板的第 2列分別加入2.5yL，每加一孔均需換一個吸頭;第3列每孔加入5yL;第4列每孔加入10yL。加 完第4孔后，將此液放入4 °C恒溫冰箱保存，取lmg/mL化合物(I)儲存液一支。第5列每孔加入 lmg/mL化合物（I)儲存液2.5yL;第6列每孔加入5yL。加完后剩余藥液放入4°C恒溫冰箱保 存。第一列不加藥物，作為對照組。至此在24孔培養(yǎng)板中化合物（I)每行都有6個濃度，分別 為0、0.5、1、2、5、1 Oyg/mL，每個濃度每列4孔(η = 4)，第一列為對照組。（3)培養(yǎng)細胞:加完藥 后，將培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱內(nèi)，在37°C、5 %C02及飽和濕度條件下，培養(yǎng)7天。培養(yǎng)至第4天時 換培養(yǎng)液一次，按上述方法配制含有15%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液40m(16mL胎牛血清加入 34mLa-MEM培養(yǎng)液中），內(nèi)含10yL青霉素8yL鏈霉素(80萬u青霉素，100萬鏈霉素分別用2mL滅 菌蒸餾水溶解），加入4yL soluble RANKL儲存液，然后取1<1，25(0!〇2〇3儲