林可霉素生物合成中間產物及其制法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物領域和生物技術工程領域，具體地，本發(fā)明涉及林可霉素生物合 成中間產物及其制法和用途。
【背景技術】
[0002] 代謝工程技術是近十多年來隨著分子生物學的發(fā)展，特別是在抗生素生物合成基 因簇克隆與抗生素生物合成途徑闡明的基礎上，在創(chuàng)新微生物藥物研究的需求中提出并逐 步發(fā)展起來的。通過運用分子遺傳學的原理和技術，特異性地合理修飾"細胞工廠"里天然 產物的合成途徑以獲得重組菌株，提高產量或優(yōu)化發(fā)酵的組份，這是當前抗生素菌種改良 的一種合理、定向而高效的新途徑。代謝工程的成功運用，關鍵是在基因和蛋白功能水平上 認識和理解復雜抗生素的生物合成及其調控機制，這是在微生物體內針對代謝途徑進行遺 傳操作的分子和生化基礎。然而，由于對林可霉素生物合成機制缺乏了解，極大地限制了這 一技術在林可霉素工業(yè)生產菌株改良上的應用。
[0003] 林可霉素（Lincomycin)及由其化學半合成的下游產品克林霉素（Clindamycin) 是臨床廣泛應用多年療效明顯的藥物。目前林可霉素主要由林可鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis)發(fā)酵生產。雖然林可霉素已臨床應用幾十年，然而對其生物合成途徑的研究 卻很少。
[0004] -直以來，本領域通過化學合成林可霉素的結構類似物或衍生物的研究不斷，然 而迄今為止已在臨床應用的林可酰胺類抗生素仍然只有林可霉素和在此基礎上化學半合 成的克林霉素兩種。通過遺傳改造林可霉素產生菌產生林可霉素生物合成的中間產物或結 構類似物，將有助于闡明林可霉素生物合成途徑的，從而基于生物合成機制研究的成果，采 用組合生物合成的手段產生新的林可酰胺類抗生素。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種林可霉素生物合成中間產物及其制法和用途。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種制備正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、Mycothiol或麥 角硫因的方法。
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化合物的結 構如式I所示：
[0008]
[0009] 式I中，&選自：Η、鹵素 、Q s烷基、C2S烯基、C2S炔基和 其中
\ *： R3選自：H、鹵素和Q s烷基；
[0010] r2 選自
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述&選自：H、C14烷基（如甲基、乙基、丙基、丁基）和
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述R3選自：H、和G 4烷基（如甲基、乙基、丙基、丁基）。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述化合物的結構如式la所示：
[0014]
[0015] 式la中，所述札、私分別如上所述。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述化合物具有選自下組式11-15所示的結構：
[0017]
[0018] 本發(fā)明的第二方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的化合物或其藥學上可接受的 鹽的用途，用作制備正丙基脯氨酸、二糖GlcN-In S、Myc〇thi〇l或麥角硫因的原料。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述用途還包括：將所述的化合物用于制備抑制微生物生長的 組合物。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述抑制微生物生長的組合物包括治療微生物或細菌感染的藥 物。
[0021 ] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，所述組合物含有本發(fā)明第一方面所述的 化合物或其藥學上可接受的鹽以及任選的載體。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括水、有機溶劑。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括藥學上可接受的載體。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為用于制備正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、 Mycothiol或麥角硫因的原料組合物。
[0026] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種微生物菌株，所述微生物為林可鏈霉菌 (Streptomycin lincolnensis)，并且所述菌株中選自下組的一個或多個基因被失活或敲 除：
[0027] ImbE、lmbE3457、ImbV、mshA、mshC、ImbC、ImbD、ImbN、和 ImbF。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述菌株中ImbE和/或lmbE3457基因被失活或敲除。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述菌株中l(wèi)mbV、mshA和/或mshC基因被失活或敲除。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述菌株中ImbC、ImbD和/或ImbN基因被失活或敲除。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述菌株中ImbF基因被失活或敲除。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述菌株用于制備本發(fā)明第一方面所述的化合物。
[0033] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種生產中間體化合物的方法，包括步驟：
[0034] (a)將權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽作為原料進行水解反應， 從而生成所述的中間體化合物，其中所述的化合物或其藥學上可接受的鹽來源于林可鏈霉 菌的發(fā)酵產物。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的中間體化合物選自下組：正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、 Mycothiol、麥角硫因或其組合。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的林可鏈霉菌包括權利要求4中所述的任一菌株。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：在步驟（a)之前，從林可鏈霉菌的發(fā)酵產物中 分離出權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)中，對選自式II、式12和式15所示的化合物中的 一種或多種進行水解反應，從而生成正丙基脯氨酸化合物。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述水解反應在堿性條件下進行。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：發(fā)酵本發(fā)明第四方面所述的微生物菌株， 從而獲得式II、式12和/或式15所示的化合物。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：發(fā)酵林可鏈霉菌突變株，從而獲得式II、 式12和/或式15所示的化合物，所述林可鏈霉菌突變株中選自下組的一個或多個基因被 失活或敲除：lmbE、lmbE3457、lmbV、mshA、mshC 和 ImbF 基因。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)中，對選自式II和式13所示的化合物中的一種或 多種進行水解反應，從而生成二糖化合物GlcN-Ins。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：發(fā)酵本發(fā)明第四方面所述的生物菌株，從而 獲得式II、和/或式13所示的化合物。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述水解反應在堿性條件下進行。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：發(fā)酵林可鏈霉菌突變株，從而獲得式II、 和/或式13所示的化合物，所述林可鏈霉菌突變株中選自下組的一個或多個基因被失活或 敲除：lmbE、lmbE3457、ImbC、ImbD、和 ImbN 基因。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)中，對選自式12和式14所示的化合物中的一種或 多種進行水解反應，從而生成麥角硫因。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：發(fā)酵權利要求4所述的微生物菌株，從而獲 得式12、和/或式14所示的化合物。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述水解反應在酸性條件下進行。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：發(fā)酵林可鏈霉菌突變株，從而獲得式12、 和/或式14所示的化合物，所述林可鏈霉菌突變株中選自下組的一個或多個基因被失活或 敲除：lmbV、mshA、mshC、ImbC、ImbD、和 ImbN 基因。
[0050] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種生產Mycohiol的方法，包括步驟：
[0051] (1)制備二糖化合物GlcN-Ins
[0052] 將權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽作為原料進行水解反應，從而 生成二糖化合物GlcN-Ins ;
[0053] (2)以 GlcN-Ins 為原料化學合成 Mycothiol。
[0054] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述的化合物的方法，包括 步驟：
[0055] (a)發(fā)酵本發(fā)明第四方面所述的菌株，從而產生本發(fā)明第一方面所述的化合物； 和
[0056] (b)從發(fā)酵產物中分離出本發(fā)明第一方面所述的化合物；和任選地將所述化合物 轉化為其藥學上可接受的鹽。
[0057] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種體外非治療性地抑制微生物生長或者殺滅微生物 的方法，包括步驟：在需要處理的場所使用本發(fā)明第一方面所述的化合物或其藥學上可接 受的鹽。
[0058] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種制備藥物組合物的方法，包括步驟：將本發(fā)明第一 方面所述的化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體進行混合，從而形成所述 藥物組合物。
[0059] 應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0060] 下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定本發(fā)明的范圍。
[0061] 圖1為林可霉素產生菌同框敲除突變株的電泳結果。圖la, ImbE敲除突變株；圖 lb，lmbE-E3457雙敲除突變株；圖lc，lmbV敲除突變株；圖ld，mshA敲除突變株；圖le，lmbC 敲除突變株；圖lf，ImbD敲除突變株；圖lg，ImbF敲除突變株。
[0062] 圖2為林可霉素產生菌同框敲除突變株的發(fā)酵液HPLC-MS檢測結果，顯示各突變 株中林可霉素 A及化合物1-5的產生情況。
[0063] 圖3為化合物1的NMR檢測結果，圖3a，lH NMR譜圖；圖3b，13C NMR譜圖；圖3c， DEPT135NMR 譜圖；圖 3d，COSY NMR 譜圖；圖 3e，HSQC NMR 譜圖；圖 3f，HMBC NMR 譜圖；圖 3g，N0ESY NMR 譜圖。
[0064] 圖4為化合物2的NMR檢測結果，圖4a，lH NMR譜圖；圖4b，13C NMR譜圖；圖4c， DEPT135NMR 譜圖；圖 4d，COSY NMR 譜圖；圖 4e，HSQC NMR 譜圖；圖 4f，HMBC NMR 譜圖；圖 4g，N0ESY NMR 譜圖。
[0065] 圖5為化合物3的NMR檢測結果。圖5a，1H NMR譜圖；圖5b，13C NMR譜圖；圖5c， DEPT135NMR 譜圖；圖 5d，COSY NMR 譜圖；圖 5e，HSQC NMR 譜圖；圖 5f，HMBC NMR 譜圖；圖 5g，N0ESY NMR 譜圖。
[0066] 圖6為化合物4的NMR檢測結果。圖6a，1H NMR譜圖；圖6b，13C NMR譜圖；圖6c， DEPT135NMR 譜圖；圖 6d，COSY NMR 譜圖；圖 6e，HSQC NMR 譜圖；圖 6f，HMBC NMR 譜圖；圖 6g，N0ESY NMR 譜圖。
[0067] 圖7為化合物5的NMR檢測結果。圖7a，1H NMR譜圖；圖7b，13C NMR譜圖；圖7c， DEPT135NMR 譜圖；圖 7d，COSY NMR 譜圖；圖 7e，HSQC NMR 譜圖；圖 7f，HMBC NMR 譜圖；圖 7g，NOESY NMR 譜圖。
[0068] 圖8為正丙基脯氨酸的NMR檢測結果，圖8a，1H NMR譜圖；圖8b，13C NMR譜圖；圖 8c，DEPT135NMR 譜圖；圖 8d，COSY NMR 譜圖；圖 8e，HSQC NMR 譜圖；圖 8f，HMBC NMR 譜圖； 圖 8g，NOESY NMR 譜圖。
[0069] 圖9為二糖化合物GlcN-Ins的NMR檢測結果，圖9a，1H NMR譜圖；圖9b，13C NMR 譜圖。
[0070] 圖10為麥角硫因的NMR檢測結果，1H NMR譜圖。
【具體實施方式】
[0071] 本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，通過對林可霉素生物合成基因簇的克隆，基因 敲除獲得了林可鏈霉菌（Streptomycin lincolnensis)突變菌株。對林可霉素生物合成相 關的蛋白進行體外生化測活，以體內體外相結合的方式對林可霉素的生物合成機制進行了 研究。意外地發(fā)現(xiàn)，某些林可鏈霉菌（Streptomycin lincolnensis)突變菌株產生了新的 化合物，隨后進行了大量的發(fā)酵，對化合物進行了分離鑒定。在此基礎上完成了本發(fā)明。 [0072] 活性成分
[0073] 如本文所用，術語"本發(fā)明的活性成分"、"本發(fā)明化合物"和"本發(fā)明的林可霉素生 物合成中間產物"可以互換使用，都指林可霉素生物合成中間產物，如式I所示的化合物。
[0074] 應理解，所述術語還包括本發(fā)明化合物的各種晶型形式、藥學上可接受的鹽、水合 物或溶劑合物。
[0075] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，術語s烷基"指具有1-8個碳原子的直鏈或支鏈 烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、或類似基團。
[0076] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，術語"C2 s烯基"是指具有2-8個碳原子的直鏈或支 鏈烯基，例如乙烯基、丙烯基、1，2- 丁烯基、2, 3- 丁烯基、丁_烯基、或類似基團。
[0077] 在本發(fā)明優(yōu)選的實