的大腸桿菌E. coli ET12567(可參見US7, 326, 782和US7, 105, 491)，通過接合轉(zhuǎn)移的方法，將質(zhì)粒lmbE、lmbV、 mshA、ImbC和ImbD基因敲除質(zhì)粒導(dǎo)入林可霉素產(chǎn)生菌Streptomycin lincolnensis NRRL ISP-5355中。lmbE3457基因敲除質(zhì)粒導(dǎo)入ImbE敲除突變株中構(gòu)建lmbE-E3457雙敲除突 變株。選出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，將接合子置于37°C生長，使質(zhì)粒基因的上游或下 游片段與染色體上的同源片段發(fā)生一次同源重組，然后將37°C生長良好的結(jié)合子接入不含 任何抗生素的TSB液體培養(yǎng)基（購自SIGMA-ALDRICH公司）中，在30°C下培養(yǎng)兩天后取少 量菌液重新接種入無抗生素的TSB液體培養(yǎng)基中，如此重復(fù)5-6輪之后，將菌液在MS固體 培養(yǎng)基上劃線，挑選喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落。抽提DNA，用PCR方法確定基因型。
[0180] 本實施例中通過上述方法，成功的構(gòu)建了林可霉素生物合成基因簇的突變菌株， 實驗結(jié)果如圖1所示。
[0181] 圖1中a為ImbE敲除突變株的驗證結(jié)果，從圖a的電泳圖可以看出，ImbE敲除突 變株中ImbE基因缺失了大約0.55kb，說明本實施例中成功地構(gòu)建了 ImbE敲除突變株。
[0182] 圖1中b為lmbE-E3457雙敲除突變株的驗證結(jié)果，在ImbE敲除突變株的基礎(chǔ)上， 進一步敲除lmbE3457,從圖b的電泳圖可以看出，lmbE-E3457雙敲除突變株中l(wèi)mbE3457基 因缺失了大約0. 34kb，說明本實施例中成功地構(gòu)建了 lmbE-E3457雙敲除突變株。
[0183] 圖1中c為ImbV敲除突變株的驗證結(jié)果，從圖c的電泳圖可以看出，ImbV敲除突 變株中ImbV基因缺失了大約0.4kb，說明本實施例中成功地構(gòu)建了 ImbV敲除突變株。
[0184] 圖1中d為mshA敲除突變株的驗證結(jié)果，從圖d的電泳圖可以看出，mshA敲除突 變株中mshA基因缺失了大約0. 6kb，說明本實施例中成功地構(gòu)建了 mshA敲除突變株。
[0185] 圖1中e為ImbC敲除突變株的驗證結(jié)果，從圖e的電泳圖可以看出，ImbC敲除突 變株中ImbC基因缺失了大約0.7kb，說明本實施例中成功地構(gòu)建了 ImbC敲除突變株。
[0186] 圖1中f為ImbD敲除突變株的驗證結(jié)果，從圖e的電泳圖可以看出，ImbD敲除突 變株中ImbD基因缺失了大約0.4kb，說明本實施例中成功地構(gòu)建了 ImbD敲除突變株。
[0187] 圖1中g(shù)為ImbF敲除突變株的驗證結(jié)果，從圖e的電泳圖可以看出，ImbF敲除突 變株中ImbF基因缺失了大約0. 5kb，說明本實施例中成功地構(gòu)建了 ImbF敲除突變株。
[0188] 實施例2重組菌株發(fā)酵
[0189] 1.種子活化及培養(yǎng)
[0190] 將-80°C保存的重組菌株的孢子涂布在MS培養(yǎng)基（甘露醇2%，黃豆餅粉2%， 瓊脂2% )上，30°C培養(yǎng)7天。切下約lcm2的含孢子和菌絲的瓊脂塊接入一級發(fā)酵培養(yǎng)基 (Soluble starch 20. 0g, Soy flour 10.0 g, Corn steep liquor 30.0 g, Glucose 10.0 g, (NH4)2S04L 5g，CaC035. 0g，pH = 7. 0)，30°C、250rpm 培養(yǎng) 40 小時，獲得用于下一步實驗的種 子培養(yǎng)液。
[0191] 2.擴大培養(yǎng)
[0192] 按10%體積的接種量將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（Glucose 100. 0g，Soy flour 25.Og, Corn steep liquor 2.Og, NaN038. Og, NaCl 5.Og, (NH4)2S048. Og, K2HP040. 2g, CaC038. 0g，pH = 7. 0)，30°C、250rpm培養(yǎng)7天，收獲發(fā)酵液，得到含有林可霉素結(jié)構(gòu)類似物 的粗產(chǎn)物。低溫保存，用于檢測和分離純化化合物。
[0193] 實施例3發(fā)酵產(chǎn)物檢測
[0194] 將lmL發(fā)酵液過濾樣品，12000r/min，離心10min ;吸取300 μ L發(fā)酵液，加入流動 相600 μ L(5mM乙酸銨：甲醇=40 :60)稀釋三倍；用渦旋儀進行充分渦旋震蕩，于4°C靜置 24h，12000r/min離心10min，取少量上清供HPLC及LC-MS檢測與分析。檢測條件為：色譜 柱采用 Agilent Z0RBAX SB-C18(5ym4. 6X250mm);檢測波長為 210nm;流動相為 5mM 乙酸 銨水溶液：甲醇（40:60);恒梯度洗脫17min ;流速為0. 6mL/min ;進樣量為20μ L。
[0195] 檢測結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出，與野生型相比，ImbE敲除突變株和 lmbE-E3457雙敲除突變株發(fā)酵產(chǎn)物中化合物1的含量明顯增加；ImbV敲除突變株和mshA 敲除突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中化合物2的含量顯著增加；ImbF敲除突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中化合物 5的含量顯著增加；ImbC敲除突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中化合物3、4的含量有所增加。而野生型 菌株中不產(chǎn)生或僅微量產(chǎn)生上述化合物。
[0196] 實施例4林可霉素結(jié)構(gòu)類似物的分離純化
[0197] 發(fā)酵液4000rpm離心20分鐘，取上清。首先用大孔樹脂XAD-2吸附突變株發(fā)酵 液，甲醇洗脫；然后對洗脫液進行濃縮，再經(jīng)Sephadax LH20凝膠柱分離，TLC/LC-MS分析確 定目標化合物富集管；接著用C18柱半制備粗分得到化合物較純化合物；最后用Sephadax G10凝膠柱對化合物進行細分進一步純化得到各目標化合物，并對各目標化合物進行結(jié)構(gòu) 鑒定。
[0198] 圖3為化合物1的NMR檢測結(jié)果，圖3a，lH NMR譜圖；圖3b，13C NMR譜圖；圖3c， DEPT135NMR 譜圖；圖 3d，COSY NMR 譜圖；圖 3e，HSQC NMR 譜圖；圖 3f，HMBC NMR 譜圖；圖 3g，N0ESY NMR譜圖。根據(jù)上述圖譜鑒定化合物1的結(jié)構(gòu)如式II所示。
[0199]
[0200] 圖4為化合物2的NMR檢測結(jié)果，圖4a，lH NMR譜圖；圖4b，13C NMR譜圖；圖4c， DEPT135NMR 譜圖；圖 4d，COSY NMR 譜圖；圖 4e，HSQC NMR 譜圖；圖 4f，HMBC NMR 譜圖；圖 4g，NOESY NMR譜圖。根據(jù)上述圖譜鑒定化合物2的結(jié)構(gòu)如式12所示。
[0201]
[0202] 圖5為化合物3的NMR檢測結(jié)果。圖5a，lH NMR譜圖；圖5b，13C NMR譜圖；圖5c， DEPT135NMR 譜圖；圖 5d，COSY NMR 譜圖；圖 5e，HSQC NMR 譜圖；圖 5f，HMBC NMR 譜圖；圖 5g，NOESY NMR譜圖。根據(jù)上述圖譜鑒定化合物3的結(jié)構(gòu)如式13所示。
[0203]
[0204] 圖6為化合物4的NMR檢測結(jié)果。圖6a，lH NMR譜圖；圖6b，13C NMR譜圖；圖6c， DEPT135NMR 譜圖；圖 6d，COSY NMR 譜圖；圖 6e，HSQC NMR 譜圖；圖 6f，HMBC NMR 譜圖；圖 6g，NOESY NMR譜圖。根據(jù)上述圖譜鑒定化合物4的結(jié)構(gòu)如式14所示。
[0205]
[0206] 圖7為化合物5的NMR檢測結(jié)果。圖7a，lH NMR譜圖；圖7b，13C NMR譜圖；圖7c， DEPT135NMR 譜圖；圖 7d，COSY NMR 譜圖；圖 7e，HSQC NMR 譜圖；圖 7f，HMBC NMR 譜圖；圖 7g，NOESY NMR譜圖。根據(jù)上述圖譜鑒定化合物5的結(jié)構(gòu)如式15所示。
[0207]
[0208] 實施例5
[0209] 藥物組合物
[0210]
[0211]
[0212] 按常規(guī)方法，將上述物質(zhì)混合均勻后，裝入普通明膠膠囊，得到1000顆膠囊。
[0213] 實施例6水解產(chǎn)生正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins和麥角硫因等下游產(chǎn)物
[0214] 正丙基脯氨酸：取5ml化合物1，2或5的水溶液（約含50mg原料）于25ml圓底 燒瓶中，滴加5N NaOH溶液至pH= 11，加熱回流3h。LC-MS監(jiān)測反應(yīng)完全后，真空除去反應(yīng) 溶劑。lml水溶解體系，用反相C18柱進行兩次半制備純化，條件：H 20(5mM)/CH30H = 80/20 ; 2ml/min;210nm紫外檢測，獲得的純正丙基脯氨酸進行核磁鑒定，結(jié)果如圖8所示，鑒定結(jié) 果表明本實施例中成功制得了正丙基脯氨酸。
[0215] 二糖GlcN-Ins :取5ml化合物1或3的水溶液（約含50mg原料）于25ml圓底燒 瓶中，滴加5N NaOH溶液至pH = 11，加熱回流3h。LC-MS監(jiān)測反應(yīng)完全后，真空除去反應(yīng)溶 劑。lml水溶解體系，用HI1IC柱進行兩次半制備純化，條件：H20(10mM)/CH3CN = 25/75 ; 2ml/min ;示差檢測，獲得的GlcN-Ins進行核磁鑒定，結(jié)果如圖9所示，鑒定結(jié)果表明本實施 例中成功制得了二糖GlcN-Ins。GlcN-Ins可用于化學(xué)合成Mycothiol的原料（化學(xué)合成 方法參考文獻：〇rg. Lett. 6, 365-368,2004 ;0rg. Lett. 12, 2630-2633,2010)。
[0216] 麥角硫因：取5ml化合物2或4的水溶液（約含50mg原料）于25ml圓底燒瓶中， 滴加5N HC1溶液至pH= 1，加熱回流3h。LC-MS監(jiān)測反應(yīng)完全后，真空除去反應(yīng)溶劑。lml 水溶解體系，用HI1IC柱進行兩次半制備純化，條件：H20(10mM)/CH3CN = 28/72 ;2ml/min ; 243nm紫外檢測，獲得的純麥角硫因進行核磁鑒定，結(jié)果如圖10示，鑒定結(jié)果表明本實施例 中成功制得了麥角硫因。
[0217] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述化合物的結(jié)構(gòu)如式I所示：式i 式I中，Ri選自；Η、因素、Cis烷基、C28帰基、C28快基矛I其中R3選 自；H、因素和烷基； Rz選自2. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述化合物具有選自下組式11-15所示的結(jié)構(gòu)：3. 如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，其特征在于，用作制備 正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、Mycothiol或麥角硫因的原料。4. 一種組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可 接受的鹽W及任選的載體。5. -種微生物菌株，其特征在于，所述微生物為林可鏈霉菌（S化巧tomycin lincolnensis)，并且所述菌株中選自下組的一個或多個基因被失活或敲除： ImbE、lmbE3457、lmbV、mshA、mshC、ImbC、ImbD、ImbN、和 ImbF。6. -種生產(chǎn)中間體化合物的方法，其特征在于，包括步驟： (a)將權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為原料進行水解反應(yīng)，從而 生成所述的中間體化合物，其中所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽來源于林可鏈霉菌的 發(fā)酵產(chǎn)物。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（a)中，對選自式II、式12和式15所 示的化合物中的一種或多種進行水解反應(yīng)，從而生成正丙基脯氨酸化合物。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（a)中，對選自式II和式13所示的化 合物中的一種或多種進行水解反應(yīng)，從而生成二糖化合物GlcN-Ins。9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（a)中，對選自式12和式14所示的化 合物中的一種或多種進行水解反應(yīng)，從而生成麥角硫因。10. -種生產(chǎn)Mycohiol的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 制備二糖化合物GlcN-Ins 將權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為原料進行水解反應(yīng)，從而生成 二糖化合物GlcN-Ins ; (2) W GlcN-Ins 為原料化學(xué)合成 Mycothiolo11. 一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括步驟： (a)發(fā)酵權(quán)利要求4所述的菌株，從而產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的化合物；和 化）從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出權(quán)利要求1所述的化合物；和任選地將所述化合物轉(zhuǎn)化為其 藥學(xué)上可接受的鹽。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一類林可霉素生物合成中間產(chǎn)物及其制法和用途。具體地，本發(fā)明提供了對林可霉素產(chǎn)生菌的遺傳改造而獲得林可霉素生物合成中間產(chǎn)物及其發(fā)酵生產(chǎn)和分離純化方法。
【IPC分類】C07H1/00, A61K31/7056, A61P31/04, C07H13/10, C07D233/84, A61P31/10, A61K31/7034, C07H17/02, C07H5/10, C12P19/64, C07H15/207, C12N1/20, C12R1/565, C07D207/16
【公開號】CN105566411
【申請?zhí)枴緾N201410625571
【發(fā)明人】劉 文, 趙群飛, 王敏, 許東嘯, 張慶林
【申請人】中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所, 中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所湖州生物制造創(chuàng)新中心
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年11月7日
【公告號】WO2016070849A1