bitor轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果 圖。
[0029] 圖2是qRT-PCR檢測miR-126_3p介導的細胞凋亡標記基因 BCL2和Caspase-3的表達 量的結(jié)果圖；其中，圖2A、圖2B圖表示的是BCL2的表達量；圖2C、圖2D圖表示的是Caspase-3 的表達量。
[0030] 圖3是Annexin ν-FITC法檢測miR-126-3p調(diào)控顆粒細胞凋亡的結(jié)果圖。
[0031 ] 圖4是驗證miR-126-3p靶向PIK3R2;其中，圖4A、圖4B、圖4C分別表示雙熒光報告基 因驗證、qRT-PCR 和 Wes tern b lott ing 驗證。
[0032] 圖5是驗證miR-126-3p靶向TSC1;其中，圖5A、圖5B、圖5C分別表示雙熒光報告基因 驗證、qRT-PCR 和 Wes tern b lott ing 驗證。
[0033] 圖6是qRT-PCR檢測3對PIK3R2和TSC1干擾小片段干擾效率;其中，圖6A表示PIK3R2 干擾小片段干擾效率;圖6B表示TSC1干擾小片段干擾效率。
[0034] 圖7是PIK3R2和TSC1干擾小片段調(diào)控顆粒細胞凋亡；圖7A為PIK3R2干擾小片段調(diào) 控結(jié)果;圖7B為TSC1干擾小片段調(diào)控結(jié)果。
[0035] 圖8是PIK3R2回復miR-126-3p抑制顆粒細胞凋亡的結(jié)果。
[0036] 圖9是TSC1回復miR-126-3p抑制顆粒細胞凋亡的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0038]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。
[0039]實施例1卵巢顆粒細胞的培養(yǎng)
[0040] (1)在屠宰場采集卵巢，用ros或者生理鹽水(含1 %雙抗)置于37°C保溫瓶迅速運 回實驗室；
[0041] (2)將收集的卵巢在無菌培養(yǎng)室用預熱過的PBS(含1 %雙抗)清洗3遍后，迅速轉(zhuǎn)入 超凈工作臺；用lmL無菌一次性注射器淺插入卵巢有腔卵泡中吸取卵泡液；
[0042] (3)吸取的卵泡液置于含有適量DMEM的15mL離心管中，lOOOrpm室溫離心6min;
[0043] (4)棄去上清，再用DMEM重懸、離心，重復清洗細胞2次;配制DMEM完全培養(yǎng)基:89% DMEM+10%FBS+1% 雙抗；
[0044] (5)吸取細胞重懸液和完全培養(yǎng)基接種于75mL培養(yǎng)瓶;置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中 靜置培養(yǎng)。
[0(Η5]所述的雙抗為青霉素和鏈霉素。
[0046] 實施例2卵巢顆粒細胞的接種和轉(zhuǎn)染
[0047] (1)顆粒細胞長至90%左右，倒掉培養(yǎng)基，用預熱的含1%雙抗(所述的雙抗為青霉 素和鏈霉素）的PBS洗3遍；
[0048] (2)加入胰蛋白酶消化，放入培養(yǎng)箱3min左右，顯微鏡下觀察至大部分細胞漂起， 立即加入等量終止液終止消化；
[0049] (3)DMEM 清洗2遍，期間 lOOOrpm 離心 5min;
[0050] (4)用完全培養(yǎng)基輕輕重懸細胞沉淀，均勻分到每個孔中，用完全培養(yǎng)基補充體 積，輕輕搖勻，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0051 ] (5) 24h左右，觀察顆粒細胞狀態(tài)，待細胞匯合度達80 %左右時準備轉(zhuǎn)染；
[0052]
[0053] (6)轉(zhuǎn)染方法按invitrogen公司的Lipofectamine? 3000試劑盒說明書進
[0054] 行;每組設置3個重復；
[0055] (7)轉(zhuǎn)染后的孔板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0056] (8)轉(zhuǎn)染后1~3天，觀察細胞狀態(tài)，生長良好即可收集細胞。
[0057] 實施例 3qRT_PCR
[0058] 本發(fā)明中基因和miRNA的qRT-PCR檢測分別采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq試劑盒和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit。實驗采用比較Ct值法檢測樣品miRNA 或基因的含量，具體計算公式如下：
[0059 ] 因相對= 2-" (舞翻通值)-(舞翻值)〉-〈(賴觀通值)-(珊翻值)"
[0060] 其中的內(nèi)參基因，對miRNA檢測用U6做內(nèi)參，對基因檢測用GAPDH做內(nèi)參，本發(fā)明所 用到的qRT-PCR引物為：
[0061 ] qRT-PCR-BCL2 Forward：57-GAAACCCCTAGTGCCATCAA-37 ；
[0062] Reverse：57-GGGACGTCAGGTCACTGAAT-37 ；
[0063] qRT-PCR-Caspase3 Forward：57-GACTGTGGGATTGAGACG-37 ；
[0064] Reverse：57-ACCCGAGTAAGAATGTGC-37 ；
[0065] qRT-PCR-PIK3R2 Forward：57-GGCAAGATCAACCGCACACAAG-37 ；
[0066] Reverse：57-CACCACCACAGAGCAGGCAT-37 ；
[0067] qRT-PCR-TSCl Forward：57-GACCCATATCTATGCGGACCC-37 ；
[0068] Reverse：57-TGCTGGTACTGAAGCGGTTG-37 ；
[0069] qRT-PCR-GAPDH Forward：57-ACGCCTGCCCTGTGTCCCAA-37 ；
[0070] Reverse：57-GAAGCACGCCCTCTCGCCTC-37 ；
[0071 ] qRT-PCR-U6 Forward：57-CTCGCTTCGGCAGCACA-37 ；
[0072] Reverse：57-AACGCTTCACGAATTTGCGT-37 ；
[0073] 細胞的總RNA提取參照Takara公司TRIzol操作說明書，具體提取步驟如下：
[0074] (1)顆粒細胞直接加入TRIzol;
[0075] (2)室溫下放置10min以充分裂解細胞，12000g離心5min，棄沉淀吸上清于新 RNase-free管中；
[0076] (3)加入0.2mL氯仿（每lmL TRIzol)劇烈震蕩15~30s，室溫下放置5min后4°C 12000g離心 15min;
[0077] (4)吸取上層水相置于新RNase-free EP管中；
[0078] (5)加入0.5mL異丙醇(每lmL TRIzol)，輕輕地上下顛倒混勾后在室溫放置10min， 4°C 12000g離心 1 Omin;
[0079] (6)棄上清后置于室溫，沿管壁加入lmL 75%乙醇-DEPC(每lmL TRIzol)以洗滌 RNA，4°C 12000g離心5min后盡量棄上清；
[0080] (7)真空干燥5~10min，注意避免RNA沉淀干燥過度；
[0081] (8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。
[0082] mRNA和miRNA反轉(zhuǎn)錄PCR分別米用Thermo公司的Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和Τ0Υ0Β0公司ReverTra Ace qPCR RT Kit〇
[0083] 實施例4 Western Blotting
[0084] (1)單層貼壁細胞總蛋白的提取:倒掉細胞培養(yǎng)液，加入適量預冷的PBS洗細胞三 次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。6孔板細胞每孔加入100~200yL蛋白裂 解液和10yL 100mM的PMSF，裂解細胞30min。收集細胞裂解液移至1.5mL離心管中，4°C 14000rpm離心5min。取部分上清加入上樣buffer，煮沸10min。緩慢恢復室溫后，稍離心，放 于-20°C保存；
[0085] (2) SDS-PAGE電泳:BCA法蛋白樣品初步定量后，每組取20yg總蛋白和5 X上樣緩沖 液按5:1混合，煮沸5min。SDS-PAGE電泳至溴酚藍剛出膠底部止；
[0086] (3)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移:PVDF膜甲醇預處理3~5s，放至轉(zhuǎn)印液浸潤30min。取出凝膠，將其 放至濾紙上，形成凝膠轉(zhuǎn)印堆積層"三明治"結(jié)構。此操作必須將氣泡完全去除。100V恒壓60 ~120min;
[0087] (4)免疫印記:取出雜交膜，TBST漂洗5min，重復三次。5 %脫脂奶粉溶液室溫封閉 90min，TBST漂洗5min，重復三次。加入PIK3R2和TSC1-抗（PIK3R2-抗:PIK3R2/p85 Beta， 購自LSBio公司；TSC1-抗:Hamartin，購自biorbyt公司）（1:2000)4°C孵育過夜，TBST洗膜 5min，三次。加入二抗稀釋液(二抗:辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，購自碧云天公 司）（1:10000)室溫孵育lh，TBST洗膜5min，三次。蒸餾水漂洗膜2min，三次。擦干PVDF膜上的 液體，加入化學發(fā)光劑放于一膠片上，放入X射線暗盒置于暗房。在暗房內(nèi)打開暗盒，放入膠 片，5min后打開暗盒，拿出膠片。采用Image Pl