us軟件分析膠片中的蛋白條帶。
[0088] 實施例5顆粒細胞凋亡檢測
[0089] 本發(fā)明中Annexin V-FITC技術檢測細胞凋亡，參照BioVision公司Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit操作說明書，具體操作步驟如下：
[0090] (1)將細胞培養(yǎng)板放置在室溫，用2mL PBS溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內細胞，去除PBS溶 液；
[0091] (2)加入不含EDTA的胰酶消化細胞，將細胞輕輕重懸于步驟(1)中的培養(yǎng)基使其密 度大約為1X10 6細胞/mL;
[0092] (3)將0.5mL細胞懸液從細胞培養(yǎng)板中（約5 X 105個細胞)轉移到一個干凈的離心 管內，加入500yL lXBinding Buffer;
[0093] (4)加5yL Annexin V-FITC和室溫5yL propidium iodide;
[0094] (5)室溫避光反應5min;
[0095] (6)立即用FACSCal ibur流式細胞儀檢測分析(每組三個重復）。
[0096] 實施例6熒光素酶報告基因活性檢測
[0097] 焚光素酶報告基因活性檢測，參照Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒，具體操作步驟如下：
[0098] (1)轉染48h后，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，每孔細胞加入100yL的Glo Lys is Buffer，室溫輕微振搖5min，收集細胞裂解液；
[0099] (2)將30yL細胞裂解液加入96孔發(fā)光板后，在其中加入75yL Dual-GI〇⑧ Luciferase Assay Reagent，混勾后在20~25°C靜置 15~30min。在BioTek公司Synergy 2 多功能酶標儀上檢測發(fā)光值，對應于螢火蟲熒光素酶的表達水平；
[0100] (3)再加入75yL Stop&Gl〇(R、lteagent試劑，混勾后在20~25°C靜置15~30min。檢 測發(fā)光值，對應于海腎熒光素酶的表達水平；
[0101] (4)螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶表達量的比值為螢火蟲熒光素酶相對活性， 即為對應靶基因活性(三個重復）。
[0102] 結果分析：
[0103] 1、制備miR-126_3p模擬物(mimic)和抑制劑（inhibitor)及檢測轉染效率。在顆粒 細胞中轉染miR-126-3p mimic和miR-126-3p inhibitor，通過qRT-PCR手段，檢測其轉染效 率，其中分別轉染濃度為50nM的miR-126_3p mimics，以及100nM的miR-126_3pinhibitor 后，相對于各自轉染的對照組NC，實驗組的轉染效率分別能達到超表達2000多倍和抑制10 多倍。結果如圖1所不。
[0104] 2、通過轉染上述效率的miR-126_3p mimic和miR-126_3p inhibitor后，檢測標記 基因的表達量，以及顆粒細胞凋亡的變化。通過qRT-PCR手段，檢測miR-126_3p介導的凋亡 標記基因的表達，發(fā)現(xiàn)過表達miR-126_3p(即轉染miR-126_3p mimic)抑制了促凋亡標記基 因 Caspase-3的表達，促進了抑凋亡標記基因 BCL2的表達;結果如圖2所示。并通過Annexin V-FITC法檢測miR-126-3p對顆粒細胞凋亡影響，結果顯示過表達miR-126-3p抑制顆粒細胞 凋亡，而抑制miR-126-3p促進顆粒細胞凋亡;結果如圖3所示。
[0105] 3、生物信息學軟件預測豬miR-126-3p的靶基因，實驗證實發(fā)現(xiàn)其靶基因為PIK3R2 和TSC1 JargetScaruMiRandaNRNAhybrid 3個生物信息學軟件預測miR-126_3p祀基因，運 用KOBAS 2.0軟件，對預測的靶基因進行作用通路分析，發(fā)現(xiàn)其靶向PI3K(磷脂酰肌醇3-激 酶)-ΑΚΤ (絲氨酸蛋白激酶)通路中關鍵PIK3R2 (磷酸酯酶基因）、TSC1 (3-磷酸肌醇依賴激 酶)基因，發(fā)現(xiàn)PIK3R2和TSC1 3^JTR中含有miR-126-3p序列結合位點，將PIK3R2和TSC1野生 型3'UTR和含有種子序列突變的3'UTR構建到真核表達載體pmirGLO中，通過雙熒光素酶報 告分析，發(fā)現(xiàn)PIK3R2和TSC1野生型（PIK3R2-WT和TSCl-rOS'UTR上游報告基因受到miR-126-3p調控，而突變型（PIK3R2-MUT和TSC1-MUT)不受miR-126-3p調控。還采用qRT-PCR和 Western blotting在轉錄水平和翻譯水平驗證miR-126-3p調控PIK3R2和TSC1的表達，發(fā)現(xiàn) miR-126-3p在轉錄及翻譯水平下調PIK3R2表達，只在翻譯水平下調TSC1表達。結果如圖4和 圖5所示。
[0106] 4、合成 3 對靶基因 PIK3R2 和 TSC1 干擾小片段 / 對照（siRNA-PIK3R2，siRNA-TSCl/ siRNA-NC)，篩選并檢測其干擾效率。結果如圖6所示。轉染基因干擾小片段到顆粒細胞中， 通過qRT-PCR手段，最終篩選干擾效果較好的siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段進行 后續(xù)實驗。
[0107] siRNA-PIK3R2-l：57-GGAGAAGUUACUUCAGGAA-37 ；
[0108] siRNA-PIK3R2-2：5/ -GGAACAACAAGCUGAUCAA-37 ；
[0109] siRNA-PIK3R2-3：5/ -GGUAUGUAGGCAAGAUCAA-37 ；
[0110] siRNA-TSCl-1:5,-GCUGGAGAUCUUAGAUUUA-3,；
[0111] siRNA-TSCl-2:5,-GCUUCGACUCUCCCUUCUA-3,；
[0112] siRNA-TSCl-3:5,-CCACGUGACAGAAAUCUAU-3,；
[0113] 上述干擾小片段由廣州市銳博生物科技有限公司合成;對照siRNA-NC來自廣州市 銳博生物科技有限公司。
[0114] 5、PIK3R2 和 TSC1 干擾小片段(siRNA-PIK3R2-l 和 siRNA-TSCl-3)轉染顆粒細胞，研 究靶基因 PIK3R2和TSC1對豬卵巢顆粒細胞凋亡的應用。通過Annexin V-FITC法檢測PIK3R2 和TSC1受到siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段干擾后后顆粒細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn) PIK3R2和TSC1促進顆粒細胞凋亡。結果如圖7所示。
[0115] 6、miR-126-3p靶基因 PIK3R2和TSC1功能回復驗證。在顆粒細胞中補充外源靶基因 PIK3R2和TSC1后，能否回復由miR-126-3p引起的細胞功能表型，顆粒細胞共轉染miR-126-3p inhibitor/NC和PIK3R2和TSC1 干擾小片段（siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3)/siRNA-NC，通過Annexin V-FITC法檢測顆粒細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p引起的抑制顆粒細胞 凋亡的功能能夠被PIK3R2和TSC1回復。結果如圖8和圖9所示。
[0116] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. miR-126-3p在豬卵巢顆粒細胞中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的miR-126-3p在豬卵巢顆粒細胞中的應用，其特征在于:所述的 miR-126-3p 的靶基因為 PIK3R2 和 TSC1。3. 根據(jù)權利要求2所述的miR-126-3p在豬卵巢顆粒細胞中的應用，其特征在于:靶基因 PIK3R2和TSC1在豬卵巢顆粒細胞中的應用。4. 根據(jù)權利要求3所述的miR-126-3p在豬卵巢顆粒細胞中的應用，其特征在于:在顆粒 細胞中補充外源干擾的靶基因 PIK3R2和TSC1后，能回復由miR-126-3p引起的細胞功能表 型。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種miR-126-3p在豬卵巢顆粒細胞中的應用，屬于細胞工程和基因工程技術領域。本發(fā)明以miR-126-3p為研究對象，采用了細胞生物學方法研究其在豬卵巢顆粒細胞中的應用。本發(fā)明第一次證實miR-126-3p、PIK3R2在豬卵巢顆粒細胞中的應用，以及在豬卵巢顆粒細胞中miR-126-3p與基因PIK3R2和TSC1之間的靶向關系；補充外源干擾的PIK3R2和TSC1能夠回復由miR-126-3p引起的細胞功能表型，進一步表明PIK3R2和TSC1在顆粒細胞中是miR-126-3p的一個重要功能靶標，miR-126-3p可以通過PIK3R2和TSC1來調節(jié)顆粒細胞的發(fā)育。
【IPC分類】C12N15/113
【公開號】CN105567686
【申請?zhí)枴緾N201610034858
【發(fā)明人】李加琪, 張愛玲, 鄧熙, 張哲 , 張豪
【申請人】華南農業(yè)大學
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月19日