抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶、表達(dá)載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域、分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新型的抗 草甘勝的5_烯醇丙酮莽草酸_3_憐酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，以及編碼上述合成酶的核酸序列，包含該序列或其編碼片段的核酸構(gòu)建 體，攜有該序列或其編碼片段或攜有所述核酸構(gòu)建體的載體，以及用所述構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn) 化的宿主細(xì)胞。另外，本發(fā)明也涉及上述新型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，編碼該 合成酶的核酸序列、核酸構(gòu)建體，重組表達(dá)載體以及用所述構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞 的使用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用除草劑進(jìn)行雜草防治，但是除草劑常常在殺滅農(nóng)作物中雜 草的同時(shí)會(huì)對(duì)農(nóng)作物本身產(chǎn)生危害，而且會(huì)傷害許多商業(yè)作物和雙子葉植物，如大豆、棉 花、馬鈴薯、油菜。利用轉(zhuǎn)基因方法可以將抗除草劑基因?qū)朕r(nóng)作物，從而使該農(nóng)作物獲得 除草劑耐受能力，因此使用除草劑能夠選擇性地殺滅雜草。在農(nóng)田中噴灑除草劑只會(huì)殺滅 雜草但是不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因的農(nóng)作物產(chǎn)生藥害，這樣的系統(tǒng)被稱為除草劑-抗除草劑的作物配 套系統(tǒng)。
[0003] 目前，一些抗除草劑基因已經(jīng)被成功地應(yīng)用于除草劑-抗除草劑的作物配套系 統(tǒng)。例如抗2,4-二氯苯氧乙酸的tfdA基因，抗溴苯腈的BXN基因和抗草丁膦的bar基因 和pat基因等。導(dǎo)入上述除草劑的植物細(xì)胞以及植株已被證明具有抗相應(yīng)除草劑的功能。
[0004] 草甘膦屬有機(jī)磷類內(nèi)吸傳導(dǎo)型滅生性除草劑，可以殺死雜草和植物。由于草甘膦 有效且生產(chǎn)成本低，對(duì)環(huán)境保護(hù)好，理化性質(zhì)穩(wěn)定并具有高效、廣譜、低毒、低殘留、易分解、 不破壞土壤環(huán)境和對(duì)大多數(shù)植物具有強(qiáng)滅生性等優(yōu)點(diǎn)，目前已是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣 泛、非常重要的一種除草劑。但部分細(xì)菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶已發(fā)現(xiàn)對(duì)草 甘膦具有抗性，因此通過基因工程被分離獲得，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)細(xì)菌的抗草甘膦功能 而獲得抗草甘膦的能力。但是為了抗性基因的多樣性，生產(chǎn)應(yīng)用中仍然需要新的抗草甘膦 基因和以此為基礎(chǔ)的抗草甘膦植物。然而，一種細(xì)菌的EPSPS是否抗草甘膦以及抗性的高 低，是不能通過EPSPS的氨基酸序列預(yù)測(cè)的。本發(fā)明提供一種新型抗草甘膦基因，該基因具 有很高的抗草甘膦能力，可以用來產(chǎn)生抗草甘膦植物，也可作為微生物和植物細(xì)胞培育中 的篩選標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是一種新型的抗草甘膦5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶以及編碼此酶 的核酸序列，用于轉(zhuǎn)到寄主包括植物中，使得寄主特別是植物能耐受草甘膦，并且可以利 用本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶清除受草甘膦污染的資源。
[0006] 本發(fā)明一個(gè)目的是涉及編碼草甘膦耐受型EPSPS基因的核酸序列（SEQ ID N〇:2)， 以及其編碼的氨基酸序列（SEQ ID N〇:l)，并克隆了其基因片段。該基因片段的序列與現(xiàn)有 技術(shù)中的土壤桿菌CP4 (Agrobacterium sp. CP4)抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸 合成酶基因序列存在差異性，通過同源性比對(duì)，結(jié)果只有47.8%的同源性（圖1)。證實(shí)了 該基因是新發(fā)明的。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種由上述核酸序列與使上述核酸序列在相應(yīng)宿主 細(xì)胞中表達(dá)所必需的調(diào)控序列可操作地連接而形成的核酸構(gòu)建體。所述調(diào)控序列具體可任 選包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化信號(hào)、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始和終止序列。
[0008] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種含有上述核酸序列或核酸構(gòu)建體的載體。
[0009] 本發(fā)明還同時(shí)提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、部分宿主生物和完整的宿主生物，其 包含上述核酸序列。該植物細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)臈l件下表達(dá)上述核酸序列所編碼的蛋白，并 使該蛋白具有EPSPS酶活性以及降解草甘膦的能力，從而使該轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞具有草甘膦 耐受性。
[0010] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述植物細(xì)胞及其后代細(xì)胞，這些細(xì)胞中含有上述核 酸序列或其編碼片段、核酸構(gòu)建體或載體，并且這些細(xì)胞具有草甘膦耐受性。
[0011] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一個(gè)在田間利用此類5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合 成酶轉(zhuǎn)化的植物和使用草甘膦的除草方法。在植物的生長(zhǎng)過程中，噴灑草甘膦。由于此類 5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)化的植物具有草甘膦耐受性，噴灑的草甘膦可以 殺死雜草，但不殺死5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)化的植物。因此利用草甘膦 可以選擇性地控制植物生長(zhǎng)中的雜草，不影響轉(zhuǎn)化了的植物的生長(zhǎng)。
[0012] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是進(jìn)一步提供了清除草甘膦對(duì)一些材料的污染的方法。此方 法包括利用本發(fā)明的微生物以及此類微生物的提取物或其產(chǎn)物，如分解草甘膦的5-烯醇 丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，能分解草甘膦，使其不對(duì)環(huán)境產(chǎn)生危害。
[0013] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是利用草甘膦耐受性的選擇性標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化的植物細(xì) 胞或植物的方法。此方法包括用本發(fā)明的此類核酸轉(zhuǎn)化至其中一部分植物細(xì)胞中，在含有 草甘膦的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以生長(zhǎng)；而非轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不能生長(zhǎng)。此 方法也包括轉(zhuǎn)化本發(fā)明的此類核酸的植物的篩選，其中成功轉(zhuǎn)化的植物在噴灑草甘膦時(shí)可 以生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化的植物不能生長(zhǎng)。
[0014] 本發(fā)明的其他目的還可以體現(xiàn)在以下對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述以及具體實(shí)施例中。
[0015] 本發(fā)明提供了從土壤及污水中分離的一種菌株，它能破壞除草劑草甘膦的活性， 避免在噴灑草甘膦時(shí)對(duì)宿主包括植物產(chǎn)生有害影響。此外，本發(fā)明還提供了一種從該菌中 分離的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，發(fā)揮著重要的作用，該酶發(fā)揮其降解草甘膦的 能力。
[0016] 本發(fā)明提供了一種抗草甘膦的EPSPS基因，并對(duì)該EPSPS基因克隆，對(duì)其進(jìn)行序 列測(cè)定，如序列表中SEQ ID N〇:2所示。本發(fā)明的EPSPS基因序列與上述提到的土壤桿菌 CP4 (Agrobacterium sp. CP4)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因氨基酸序列只有 47. 8%的同源性，核酸序列差異明顯。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述核苷酸序列的變體，例如在該序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行任何改動(dòng)， 如剪切、插入或替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸，通過檢測(cè)鑒定，如果所得新的核酸序列能編碼具有 EPSPS活性的蛋白，那么就屬于本發(fā)明的內(nèi)容。
[0018] 本發(fā)明還同時(shí)提供了上述基因編碼的草甘膦蛋白，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列 表中SEQ ID No:l所示。
[0019] 本發(fā)明中抗草甘膦的蛋白質(zhì)也可以用人工方法引入一個(gè)或多個(gè)變異而獲得保持 有抗草甘膦能力的變異分子，比如對(duì)該序列進(jìn)行剪切、插入或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基， 通過篩選獲得具有抗草甘膦能力的新的蛋白質(zhì)分子，屬于本發(fā)明的內(nèi)容。
[0020] 將本發(fā)明編碼EPSPS的核苷酸序列與相對(duì)于該序列同源或異源的其它序列可操 作地連接，就構(gòu)成本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明的抗草甘膦基因的核酸片段可以進(jìn)一步構(gòu) 建包含表達(dá)構(gòu)件的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。這個(gè)表達(dá)構(gòu)件包括啟動(dòng)子、抗草甘膦基因和終止子。
[0021] 這個(gè)抗草甘膦基因表達(dá)構(gòu)件可以通過植物的轉(zhuǎn)化被整合到植物的基因組中，從而 穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。該表達(dá)構(gòu)件可以通過農(nóng)桿菌或基因槍等方法導(dǎo)入植物的未成熟胚、成熟 胚、未分化的愈傷組織或原生質(zhì)體中表達(dá)。
[0022] 利用本發(fā)明的基因所編碼的蛋白質(zhì)序列，可以設(shè)計(jì)和人工合成密碼子優(yōu)化的有利 于在植物中表達(dá)的核苷酸序列。只要該序列具有草甘膦耐受性，就屬于本發(fā)明的范圍。利 用DNA2. 0等軟件對(duì)該基因的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，利用生物學(xué)軟件DNAMAN等對(duì)優(yōu)化后的 序列作限制性酶切分析，對(duì)含有常見酶切位點(diǎn)的密碼子進(jìn)行同義修飾，消除常用酶切位點(diǎn)。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的方法，可將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，或者直接將本發(fā)明的分離的核酸 序列導(dǎo)入載體，用該載體轉(zhuǎn)化特定的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)本發(fā)明的EPSPS酶并使得該重組 宿主細(xì)胞獲得草甘膦耐受性?；蛘卟煌ㄟ^載體轉(zhuǎn)化，而是直接將本發(fā)明的分離的核酸序 列，或本發(fā)明的核酸構(gòu)建體用常規(guī)方法，如電穿孔等導(dǎo)入宿主細(xì)胞，同樣可以表達(dá)本發(fā)明的 EPSPS酶并賦予該細(xì)胞草甘膦耐受性。如此所獲得的載體和重組宿主細(xì)胞，以及獲得該細(xì)胞 的方法，都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0024] 本發(fā)明所提供的對(duì)植物進(jìn)行改造的方法是：利用序列表中SEQ ID No:2所示的或 與其具有同源性的基因或?qū)υ摶蛐蛄羞M(jìn)行植物密碼子優(yōu)化的基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再將轉(zhuǎn) 化后的植物細(xì)胞培育成相應(yīng)植株，從而使這些轉(zhuǎn)基因植物獲得抗草甘膦的能力。植物可選 大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、小麥、大麥、高粱、馬鈴薯、甘藍(lán)、白菜和青椒等。
[0025] 本發(fā)明涉及了常用草甘膦耐受性的選擇性標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或