第二輪PCR，反應(yīng)體系及條件同上述5'端擴增。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得長約400bp的片段，按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit的方法回收純化PCR產(chǎn)物，進(jìn)行序列測定，命名為A8-Cterm_373F-〇neseq。
[0111] e)開放閱讀框分析
[0112] 經(jīng)過3'端及5'端的擴增，將所有獲得的6個序列分別進(jìn)行拼接后，獲得5'端和 3'端兩段序列，用DNAStar-MegAlign軟件將這兩段序列與A8的EPSPS序列比較分析，兩個 EPSPS序列的相似度達(dá)到100%。
[0113] 從5'端序列和3'端序列各設(shè)計一只引物并分別引入如下劃線所示的BamH I和 HindllI酶切位點
[0114] 引物 12(A8-EPSPS-0RF-FP) :5, -CGGGATCCATG AGC AGC AGC ACG CAC CAC-3，
[0115] 引物 13(A8-EPSPS-0RF-RP) :5, -CTC GTA AGCTTCTA CTG AAG CCG TTT CGC-3，
[0116] 以A8基因組DNA為模板，用引物12和引物13進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：95°C5min，然 后以95°C 30s、69°C 45s、72°C lmin進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸7min。擴增得到A8 EPSPS 基因的ORF，進(jìn)行測序，再將該序列與前面獲得的6個序列進(jìn)行拼接，最終獲得A8 EPSPS的 全長序列，如序列表中SEQ ID No:2所示序列。
[0117] f)EPSPS氨基酸同源性分析
[0118] 運用氨基酸比對方法如BLAST,對本發(fā)明的EPSPS和已發(fā)明的土壤桿菌 CP4 (Agrobacterium sp. CP4)EPSPS(GeneBank :Q9R4E4. 2)進(jìn)行比對，本發(fā)明 EPSPS 的 444個氨基酸與土壤桿菌CP4 (Agrobacterium sp.CP4)EPSPS 455個氨基酸的同源性為 47. 8%，土壤桿菌CP4(Agrobacterium sp. CP4)EPSPS是現(xiàn)在世界上應(yīng)用最廣泛的抗草甘膦 EPSPS基因，它對高濃度的草甘膦表現(xiàn)出非常高的抗性。對比表明兩個基因具有一定的同源 性同時也具有明顯的差異如圖1。
[0119] 實施例4. EPSPS基因草甘膦耐受性功能驗證
[0120] a) A8 EPSPS蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
[0121] 將實施例2的e)中獲得的PCR產(chǎn)物片段回收后用EcoRI和Hindlll酶切，插入經(jīng) 過BamH I和Hindlll酶切的pET28a中后，轉(zhuǎn)入BL21，得到質(zhì)粒BL21-1，測序證實無誤。
[0122] 選擇28單克隆，一個BL21做陰性對照，在LB/Kan液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至0D = 〇. 6,分別加入IPTG至終濃度0. 5mM后，轉(zhuǎn)到28°C培養(yǎng)6小時。菌液離心收集相同量，加入 30μ 1 lXprotein Buffer懸浮細(xì)胞，沸水中煮5分鐘后離心收集上清液。分別取15μ 1進(jìn) 行SDS-PAGE電泳。
[0123] SDS-PAGE配置方法如下：
[0124] 12%分離膠（51111):水1.61111，1.511^8-(：1，？!18.81.31111，10%5050.051111，30%丙 烯酰胺/〇. 8%甲叉雙丙烯酰胺2. 0ml，10 %過硫酸銨0. 05ml，TEMED 0. 002ml。
[0125] 6 % 積層膠（2ml):水 1.4ml，1.0M Tris-HCl，pH 6.80.25ml，10 % (w/v)SDS 0. 02ml，30 %丙烯酰胺/0. 8 %甲叉雙丙烯酰胺0. 33ml，10 %過硫酸銨0. 02ml，TEMED 0·002ml〇
[0126] 電泳在BioRad垂直電泳儀上進(jìn)行，首先使用80ν電壓進(jìn)行30分鐘，然后將電壓升 至120ν直到溴酚藍(lán)跑至膠底部。電泳結(jié)束后將膠小心取出首先洗去殘留電泳液，并使用考 馬斯亮藍(lán)染色液高溫染色2-3min。然后使用純凈水高溫脫色30min，重復(fù)脫色至條帶清晰 可見。結(jié)果表明，含有pET28a-EPSPS的BL21含有目的蛋白表達(dá)。如圖2
[0127] b)含有A8 EPSPS基因的BL21對草甘膦抗性實驗
[0128] 在4個含有900mM草甘勝的Reduced Chlorine固體培養(yǎng)基平板（直徑90mm)上 分別涂上200 μ 1 20mM的IPTG，待IPTG溶液全部吸入平板后，分別涂布BL21菌液、含有 pET28a的BL21菌液、含有pET28a-EPSPS的BL21以及A8菌液，A8放于30°C，其余放于37°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有pET28a-EPSPS的BL21和A8兩個平板有單克隆長出， 而另外兩個菌液在該平板上不能生長。如圖3
[0129] c)含有A8 EPSPS基因的BL21在液體草甘膦培養(yǎng)基中的生長實驗
[0130] 在6個含有900mM草甘膦的Reduced Chlorine液體培養(yǎng)基中分別加入終濃度 20mM的IPTG，然后加入BL21菌液、含有pET28a的BL21菌液、含有pET28a-EPSPS的BL21-A8 EPSPS-2菌液，A8菌液，大腸桿菌JM109以及DH5 α進(jìn)行培養(yǎng)。A8菌放于30°C，其余放于 37°C搖床培養(yǎng)，每隔12小時取樣，用HITACHI U-3000型分光光度計進(jìn)行菌液濃度0D600測 定，直至60小時。獲得A8和含A8 EPSPS的BL21及其他各菌液生長曲線。如圖4。
【主權(quán)項】
1. 一種抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸 序列如序列表中SEQ ID No :1的所示，在SEQ ID No :1的所示的氨基酸序列中取代不顯著 影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸和添加一個或多個氨基酸而產(chǎn)生的抗草甘膦的 5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，優(yōu)選地，所述的氨基酸包括不改變特定活性的酸性氨 基酸、堿性氨基酸、芳香氨基酸、疏水性氨基酸、極性氨基酸，以及小分子氨基酸。2. 編碼如權(quán)利要求1所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的核酸，核酸序列 如 SEQ ID No :2 所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征是，所述的基因與如權(quán)利要求1所述基因具有 90%以上的同源性，優(yōu)選地，所述的基因與如權(quán)利要求2所述基因具有95%以上的同源性。4. 一種DNA質(zhì)粒，其特征在于：所述的質(zhì)粒含如權(quán)利要求1所述的基因并且與能夠在 植物有功能的啟動子連接。5. -種DNA質(zhì)粒，其特征在于：所述的質(zhì)粒含如權(quán)利要求1所述的基因或者基因片段 構(gòu)建得到的核酸構(gòu)建體。6. -種核酸構(gòu)建體或攜有所述核酸構(gòu)建體的載體，其特征在于： 含編碼如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因或者基因片段構(gòu)建得到的核酸構(gòu)建體或所述 核酸構(gòu)建體的載體。7. -種利用如權(quán)利要求1所述的基因產(chǎn)生抗草甘膦的植物細(xì)胞和植物的方法，該方法 包括以下步驟： 1) 將如權(quán)利要求1所述的基因的上游端沿有義方向上連接于啟動子的核酸片段之后， 其下端連接于一種用于控制轉(zhuǎn)錄終止的合適調(diào)控序列的核酸片段之前，進(jìn)而構(gòu)建植物表達(dá) 載體； 2) 將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞； 3) 在26-28°C、光照強度1500-20001uk(10-12h)、PH 5. 8-6. 0條件下將轉(zhuǎn)化后的植物 細(xì)胞再生，得到表達(dá)目的基因的植株。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述的啟動子包含組成型啟動子、組織特 異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、器官特異性啟動子或者由啟動子和調(diào)控元件組成的復(fù)合啟動 子。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述的轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 方法、原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法、基因槍、花粉管通道法、電擊法轉(zhuǎn)化方法。
【專利摘要】一種抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列表中SEQ？ID？No：1的所示，在SEQ？ID？No：1的所示的氨基酸序列中取代不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸和添加一個或多個氨基酸而產(chǎn)生的抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶。本發(fā)明可以大幅度簡化農(nóng)作物的雜草防治方式，擴大草甘膦的應(yīng)用范圍，同時本發(fā)明還可以消除草甘膦給環(huán)境帶來的影響，凈化環(huán)境。本發(fā)明的基因可用于制備對草甘膦產(chǎn)生了抗性的轉(zhuǎn)基因宿主包括植物。
【IPC分類】C12R1/64, C12N15/82, C12N5/10, C12N9/10, C12N15/54, A01H5/00
【公開號】CN105567710
【申請?zhí)枴緾N201410621641
【發(fā)明人】魯茂龍
【申請人】南通龍翔生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年11月6日