一種丁酸產(chǎn)量低且丁醇產(chǎn)量高的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種丁酸產(chǎn)量低且丁醇產(chǎn)量高的工程菌及其 構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 能源與環(huán)境是當(dāng)今社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著化石能源的日漸枯竭和自然環(huán)境的污 染，人類對(duì)可再生能源的需求越來(lái)越強(qiáng)烈。利用微生物轉(zhuǎn)化或發(fā)酵可再生資源高效生產(chǎn)可 再生能源是今后的能源發(fā)展趨勢(shì)，這種通過(guò)生物法生產(chǎn)化學(xué)品的方式是可持續(xù)的且環(huán)境友 好的。
[0003] 丁醇是一種重要的化工品和原料，可直接用作有機(jī)溶劑，是合成多種酯類化合物 的前體，廣泛應(yīng)用于各種塑料和橡膠制品中。同時(shí)，丁醇也是優(yōu)良的可替代汽油的生物燃 料。它具有和汽油相當(dāng)?shù)臒嶂蹬c辛烷值，可與汽油以任意比例混合;在運(yùn)輸過(guò)程中，不易腐 蝕管道;與乙醇相比，其蒸汽壓低，安全性高，因此是一種極具潛力的新型生物燃料。目前， 丁醇的年市場(chǎng)需求大約在百萬(wàn)噸級(jí)別。
[0004] 丁醇可由生物合成是巴斯德于1861年首次發(fā)現(xiàn)的，1912年，魏茲曼(Weizmann)發(fā) 現(xiàn)了一種梭菌Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為丙酮、丁醇 及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酮丁醇梭菌，以期得到可用于工業(yè)化生產(chǎn)丁醇的工 程菌株。但是，丙酮丁醇梭菌是一種嚴(yán)格厭氧生長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其遺傳操作系統(tǒng)復(fù) 雜，不利于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的研究和工業(yè)的生產(chǎn)。2008年，Shota Atsumi,James C.Liao等首先 在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了丁醇的合成（Atsumi S，Cann A F，Connor M R，et al .Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production.Metabolic engineering ,2008,10(6) :305-311 ·)，該研究組將丙酮丁醇梭菌體內(nèi)的丁醇合成途徑轉(zhuǎn)移 至大腸桿菌內(nèi)，致使其可產(chǎn)生少量丁醇。隨后，該研究組對(duì)整條途徑進(jìn)行了優(yōu)化，將以NADH 為還原力，催化可逆反應(yīng)巴豆酰輔酶A生成丁酰輔酶A的丁酰輔酶A脫氫酶復(fù)合物（Bcd-EtfAB complex)替換為來(lái)自齒垢密螺旋體(Treponema denticola)的催化不可逆反應(yīng)的反 式烯酰輔酶A還原酶(Ter);催化乙酰輔酶A生成乙酰乙酰輔酶A的酶，由乙酰乙酰輔酶A硫解 酶(Th 1)換為大腸桿菌中活性更強(qiáng)的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(AtoB)，由此形成了NADH和乙酰 輔酶A的驅(qū)動(dòng)力，丁醇產(chǎn)量大幅度提高。
[0005] 雖然，大腸桿菌可以通過(guò)梭菌的丁醇途徑生產(chǎn)丁醇，但是，該過(guò)程往往伴隨著一系 列副產(chǎn)物的產(chǎn)生，丁酸是其中占比例較大的副產(chǎn)物之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建重組菌的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的方法，為抑制或沉默生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA 表達(dá)，得到重組菌。
[0008] 上述方法中，所述抑制或沉默生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA表達(dá) 為敲除生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA。
[0009] 上述方法中，所述敲除生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因采用λ-r ed同源重組系統(tǒng)、sacB基因介導(dǎo)篩選的同源重組系統(tǒng)或CRI SPR/Cas系統(tǒng)。
[0010] 上述方法中，所述敲除生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因?yàn)椴捎?λ-red同源重組系統(tǒng)將生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為FRT;
[0011]或所述敲除生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因?yàn)椴捎忙?red同源 重組系統(tǒng)將生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為兩端帶有FRT的標(biāo)記 基因；
[0012] 所述FRT的核苷酸序列為序列17第59-106位。
[0013] 上述方法中，所述標(biāo)記基因?yàn)榭敲顾乜剐曰颍?br>[0014] 所述兩端帶有FRT的標(biāo)記基因片段的核苷酸序列為序列表中序列17第4H534位。
[0015] 上述方法中，所述生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌為將丙酮丁醇梭 菌體內(nèi)的丁醇合成途徑轉(zhuǎn)移至出發(fā)大腸桿菌得到的菌；
[0016] 所述大腸桿菌具體為EB228CGMCC No. 11986;
[0017] 所述出發(fā)大腸桿菌具體為大腸桿菌BW25113。
[0018] 上述方法中，所述硫酯酶的氨基酸序列為序列21;
[0019] 所述硫酯酶yciA基因的核苷酸序列具體為序列7。
[0020] 上述方法中，所述將生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為 FRT的方法包括如下步驟：
[0021] 1)將含有硫酯酶基因 yciA的上游同源臂、抗性基因和硫酯酶基因 yciA的下游同源 臂的同源DNA分子導(dǎo)入EB228(pKD46)，得到y(tǒng)ciA替換為兩端帶有FRT的卡那霉素抗性基因片 段的中間菌；
[0022] 所述含有硫酯酶基因 yciA的上游同源臂、抗性基因和硫酯酶基因 yciA的下游同源 臂的同源DNA分子的核苷酸序列為序列17;
[0023] 所述EB228 (pKD46)為將質(zhì)粒pKD46導(dǎo)入EB228中得到的菌；
[0024] 2)將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)入所述中間菌，使所述pCP20質(zhì)粒上的FRT替換了中間菌中的卡 那霉素抗性基因，得到去除卡那霉素抗性基因的中間菌；
[0025] 3)將所述去除卡那霉素抗性基因的中間菌先在37°C培養(yǎng)去除了溫敏質(zhì)粒pCP20和 PKD46，得到去除溫敏質(zhì)粒的中間菌；
[0026] 4)將所述去除溫敏質(zhì)粒的中間菌分別在卡那霉素抗性培養(yǎng)基、氯霉素抗性培養(yǎng) 基、無(wú)卡那霉素且無(wú)氯霉素平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取只在所述無(wú)卡那霉素且無(wú)氯霉素平板 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且在所述卡那霉素抗性培養(yǎng)基和所述氯霉素抗性培養(yǎng)基均不生長(zhǎng)的菌，為 重組菌；
[0027] 所述將生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為兩端帶有FRT的 標(biāo)記基因的方法為所述將生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為FRT的 方法中的步驟1)。
[0028]由上述方法制備的重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029]上述方法或上述重組菌在生產(chǎn)丁醇或提高丁醇產(chǎn)量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的 范圍；
[0030] 或上述方法或上述重組菌在生產(chǎn)丁酸或降低丁酸產(chǎn)量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍。
[0031] 或上述方法或上述重組菌在生產(chǎn)丁醇且降低副產(chǎn)物丁酸產(chǎn)量中的應(yīng)用也是本發(fā) 明保護(hù)的范圍。
[0032] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)丁醇和/或丁酸的方法。
[0033] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:發(fā)酵上述重組菌，得到丁醇和/或丁酸。
[0034] EB228菌已于2016年1月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 11986,分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。
[0035]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明中可促進(jìn)大腸桿菌生產(chǎn)丁醇的改造靶點(diǎn)為硫酯酶基因 yciA，通過(guò)λ-red同源重組系統(tǒng)敲除技術(shù)，在一株產(chǎn)丁醇的大腸桿菌EB228CGMCC No.11986 中將基因組上的硫酯酶基因 yciA替換為FRT，得到重組菌，與EB228CGMCC No. 11986相比，該 重組菌發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸產(chǎn)量明顯下降，丁醇產(chǎn)量有較明顯的上升，可以用于丁醇高產(chǎn)量生 產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為EB228體內(nèi)的丁醇生產(chǎn)途徑。
[0037]圖2為基因敲除的過(guò)程示意圖。
[0038]圖3為出發(fā)菌株與突變體菌株在小管中發(fā)酵的丁酸產(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量。
[0039]圖4為EB228 Δ yciA發(fā)酵液使用高效液相色譜(HPLC)分析的結(jié)果示意圖。
[0040]圖5為使用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)鑒定丁酸標(biāo)準(zhǔn)品的總離子色譜圖。
[0041 ]圖6為中出發(fā)菌EB228(A)與工程菌EB228 Δ yciA(B)發(fā)酵液使用氣質(zhì)聯(lián)用鑒定丁酸 的總離子色譜圖。
[0042]圖7為丁酸的質(zhì)譜特征離子峰(A)和對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索結(jié)果(B)。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0044] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045] 下述實(shí)施例大腸桿菌為將丙酮丁醇梭菌體內(nèi)的丁醇合成途徑轉(zhuǎn)移至BW25113得到 的菌，具體為EB228CGMCC No.11986。
[0046] EB228菌已于2016年1月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 11986,分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。
[0047] 實(shí)施例1、敲除大腸桿菌EB228中硫酯酶基因制備重組菌
[0048] 下面的實(shí)施例用的是λ-red同源重組系統(tǒng)進(jìn)行敲除硫酯酶基因，其中涉及的質(zhì)粒：
[0049] pKD4記載在如下文獻(xiàn)中：Datsenko，Kirill A·，and Barry L. Wanner · One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products .Proceedings of the National Academy of Scien