[0171] 10-F：TGCCGTACTGACCGCTGAACAAGCCCTG
[0172] 10-R：CCTACCATATAGGTGGCGGTGGCACTGG
[0173] 實(shí)施例2、敲除硫酯酶基因的10個(gè)重組菌的小管發(fā)酵測(cè)試
[0174] 將實(shí)施例 1 得到的 10 個(gè)突變體EB228-1#、EB228-2#、EB228-3#、EB228-4#、EB228-5#、EB228-6#、EB228-7#、EB228-8#、EB228-9#、EB228-10#與EB228用滅菌的牙簽接種至含 20g/L葡萄糖的M9Y培養(yǎng)基中置于37°C靜置發(fā)酵72h，得到發(fā)酵液。
[0175] 上述含20g/L葡萄糖的M9Y培養(yǎng)基配制方法如下：分別稱取6g Na2HP〇4,3g KH2P〇4， 0.5g NaCl，lg NH4CI溶于一定量的蒸餾水，稱取20g葡萄糖溶于一定量的蒸餾水，稱取2g酵 母粉溶于一定量的蒸餾水，三者的總體積為1升。在121°C條件下滅菌15min，冷卻后將三者 混合，并添加已滅菌的終濃度分別為2mmo 1/1的MgS〇4和0.1 mmo 1 /1的CaC 12。將最終配制好的 培養(yǎng)基分裝至無菌的15ml離心管(BD Biosciences)內(nèi)，每管分裝10ml培養(yǎng)基。每個(gè)菌株設(shè) 置三個(gè)平行，擰緊離心管的螺旋蓋后再擰松半圈。
[0176] 取上述發(fā)酵液離心后的上清液經(jīng)孔徑大小為0.22μπι的過濾器過濾后進(jìn)行高效液 相色譜分析，分析采用Agilent 1260液相色譜儀，示差折光檢測(cè)器，BioRad Aminex ΗΡΧ-87H有機(jī)酸柱，柱溫15°C，流動(dòng)相為5mmol/l硫酸水溶液，流速0.5ml/min，進(jìn)樣量10μ1。
[0177] 標(biāo)準(zhǔn)品為葡萄糖、丁酸、丁醇，保留時(shí)間依次為10.2min，26.6min，39.8min左右，發(fā) 酵液上清在相應(yīng)時(shí)間也有峰出現(xiàn)，說明發(fā)酵液上清中確實(shí)含有葡萄糖、丁酸、丁醇。
[0178] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定的計(jì)算公式為：
[0179]葡萄糖濃度的計(jì)算公式:7 = 194111^，1?2 = 0.9999，其中1表示葡萄糖濃度(8/1)，7 表示實(shí)際峰面積；
[0180] 丁酸濃度的計(jì)算公式:y = 129755x，R2 = 0.9998，其中X表示丁酸濃度(g/L)，y表示 實(shí)際峰面積；
[0181] 丁醇濃度的計(jì)算公式:7 = 138232^妒=0.9998，其中1表示丁醇濃度化/1)，7表示 實(shí)際峰面積。
[0182] 計(jì)算得到的各菌株的丁酸與丁醇產(chǎn)量如下表2、圖3(A為丁酸產(chǎn)量，B為丁醇產(chǎn)量） 和圖4所示，發(fā)酵液上清液中含有丁酸和丁醇，與未敲除yciA基因的EB228相比，所有敲除硫 酯酶基因的10個(gè)重組菌的丁酸產(chǎn)量降低，尤其敲除yciA基因重組菌EB228-7#的丁酸產(chǎn)量明 顯降低，且丁醇產(chǎn)量有小幅度提升。
[0183] 表2HPLC分析EB228及其10個(gè)硫酯酶基因突變體的丁酸與丁醇產(chǎn)量表
[0184]
[0185] 實(shí)施例3、重組菌EB228 Δ yciA的制備
[0186] 將實(shí)施例1中得到的EB228-7#即EB228AyciA: :kan接至含50μg/ml卡那霉素的液 體LB中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期時(shí)制備感受態(tài)細(xì)胞，電擊轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCP20至其中，30°C復(fù) 壯lh，涂布于含30μg/ml氯霉素的LB平板上，30°C培養(yǎng)12h，使pCP20質(zhì)粒上的FRT替換中間菌 中的卡那霉素抗性基因。
[0187] 上述涂布的平板上長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接至無抗的液體LB中，37°C培養(yǎng)，經(jīng)過兩次傳代 培養(yǎng)后，稀釋涂布于無抗平板上，37 °C培養(yǎng)12h，經(jīng)過2次37 °C培養(yǎng)去除了溫敏質(zhì)粒pCP20 (氯 霉素抗性)和pKD46(氨芐青霉素抗性）。
[0188] 挑取上述稀釋涂布平板上的單菌落依次劃線至卡那霉素抗性平板、氯霉素抗性平 板、無抗平板，37°C培養(yǎng)12h。之后，篩選出只在無抗平板上生長(zhǎng)，在其他兩種平板上對(duì)應(yīng)不 生長(zhǎng)的菌落即為yciA基因敲除成功的重組菌，命名為EB228Ay CiA。
[0189] 重組菌EB228 AyCiA為將EB228基因組上的yciA基因替換為FRT(序列17的第59-106位)得到的重組菌。
[0190] 實(shí)施例4、重組菌EB228AyCiA的小管發(fā)酵測(cè)試
[0191] 按照實(shí)施例2的方法對(duì)重組菌EB228 Δ yciA和EB228進(jìn)行小管發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn) 行HPLC檢測(cè)(方法同實(shí)施例2)，結(jié)果如下表3所示：
[0192] 表3HPLC分析EB228和EB228 Δ yciA的丁酸與丁醇產(chǎn)量表
[0193]
[0194] 可以看出，敲除硫酯酶基因 yciA得到的重組菌EB228AyCiA較出發(fā)菌EB228丁酸產(chǎn) 量降低72%，丁醇產(chǎn)量上升18%，因此EB228 Δ yciA即為目的工程菌。
[0195] 實(shí)施例5、目的工程菌EB228AyCiA發(fā)酵產(chǎn)物中丁酸的氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)檢測(cè)
[0196] 將實(shí)施例4中處理得到的發(fā)酵液再進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，以進(jìn)一步確定副產(chǎn)物丁酸及其 濃度。
[0197] 氣質(zhì)聯(lián)用條件:Rtx_Wax柱，柱長(zhǎng)30m，不分流，進(jìn)樣量ΙμL;使用氦氣作為載氣，流量 4.7ml/min，升溫程序?yàn)?50°C 保持 lmin，5°C/min 的速率升溫至 100°C，保持 10min，20°C/min 的速率升溫至180°C，保持0min，50°C/min的速率升溫至200°C，保持2min;質(zhì)譜檢測(cè)采用SM 模式，進(jìn)樣口溫度為250 °C，特征離子設(shè)定為:55m/z，60m/z，62m/z，69m/z，73m/z。
[0198] 經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用分析，EB228與工程菌EB228 Δ yciA的發(fā)酵液中含有與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間 高度一致的、含有標(biāo)準(zhǔn)品丁酸特征離子譜的目標(biāo)峰(見圖5與圖6)，相應(yīng)的質(zhì)譜圖見圖7。根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定的丁酸濃度計(jì)算公式為:y = 11262x，R2 = 0.9996， 其中x表示物質(zhì)的濃度(g/L)，y表示實(shí)際峰面積。通過氣質(zhì)聯(lián)用分析的EB228與工程菌EB228 Δ yciA發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸和用高效液相色譜分析的丁酸產(chǎn)量基本一致，結(jié)果如下表4所示：
[0199] 表4GC-MS分析EB228和工程菌EB228 Δ yciA的丁酸產(chǎn)量表
[0200]
[0201]
[0202] 可以看出，與EB228相比，敲除硫酯酶基因 yciA得到的工程菌EB228AyCiA丁酸產(chǎn) 量確實(shí)明顯降低。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種構(gòu)建重組菌的方法，為抑制或沉默生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA表達(dá)，得到重組菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述抑制或沉默生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組 上的硫酯酶基因 yciA表達(dá)為敲除生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述敲除生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫 酯酶基因 yciA基因采用λ-red同源重組系統(tǒng)、sacB基因介導(dǎo)篩選的同源重組系統(tǒng)或CRISPR/ Cas系統(tǒng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述敲除生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上 的硫酯酶基因 yciA基因?yàn)椴捎忙?red同源重組系統(tǒng)將生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶 基因 yciA基因替換為FRT; 或所述敲除生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因?yàn)椴捎忙?red同源重組 系統(tǒng)將生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌基因組上的硫酯酶基因 yciA基因替換為兩端帶有FRT的標(biāo)記基 因； 所述FRT的核苷酸序列為序列17第59-106位。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于： 所述標(biāo)記基因?yàn)榭敲顾乜剐曰颍? 所述兩端帶有FRT的標(biāo)記基因片段的核苷酸序列為序列表中序列17第41-1534位。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌為將丙酮丁醇梭菌體內(nèi)的丁醇合成 途徑轉(zhuǎn)移至出發(fā)大腸桿菌得到的菌； 所述大腸桿菌具體為EB228 CGMCC No. 11986; 所述出發(fā)大腸桿菌具體為大腸桿菌BW25113。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述硫酯酶的氨基酸序列為序列21; 所述硫酯酶yciA基因的核苷酸序列具體為序列7。8. 由權(quán)利要求1-7中任一所述方法制備的重組菌。9. 權(quán)利要求1-7中任一所述方法或權(quán)利要求8所述重組菌在生產(chǎn)丁醇或提高丁醇產(chǎn)量 中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1-7中任一所述方法或權(quán)利要求8所述重組菌在生產(chǎn)丁酸或降低丁酸產(chǎn)量 中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1-7中任一所述方法或權(quán)利要求8所述重組菌在生產(chǎn)丁醇且降低副產(chǎn)物丁 醇產(chǎn)量中的應(yīng)用。10. -種生產(chǎn)丁醇和/或丁酸的方法，發(fā)酵權(quán)利要求8所述重組菌，得到丁醇和/或丁酸。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種丁酸產(chǎn)量低且丁醇產(chǎn)量高的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種構(gòu)建重組菌的方法，為抑制或沉默生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌的基因組上的硫酯酶基因yciA表達(dá)，得到重組菌。本發(fā)明通過將生產(chǎn)丁醇的出發(fā)菌EB228CGMCC？No.11986基因組上的硫酯酶YciA基因yciA替換為FRT，得到重組菌，該重組菌發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸產(chǎn)量明顯下降，丁醇產(chǎn)量有較明顯的上升，可以用于丁醇高產(chǎn)量生產(chǎn)。CGMCC No.1198620160111
【IPC分類】C12R1/19, C12N1/21, C12P7/52, C12N15/70, C12P7/16
【公開號(hào)】CN105567722
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610034891
【發(fā)明人】趙春華, 董紅軍, 張延平, 李寅
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院微生物研究所
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年1月19日