一種核桃低聚肽粉及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種高純度、低分子量的核桃柏抗氧化肽產(chǎn)品，其多肽含量在80wt % 以上，分子量小于1500Dalton在95%以上。本發(fā)明還涉及到核桃蛋白的制備并催化酶解，生 成低聚抗氧化肽粉的制備方法，該肽粉可用作保健食品或者藥品。
【背景技術(shù)】
[0002] 核桃(Juglans regia L)又名胡桃，屬于四大堅果之一，具有很高的營養(yǎng)藥用價 值。在我國古醫(yī)藥書籍中，有明確記載，李時珍《本草綱目》記述"補氣養(yǎng)血、潤燥化痰、益命 門、利三焦，溫肺潤腸。治肺潤腸。治虛寒喘咳，腰腳重疼，心腹疝痛，血痢腸風，散腫毒，"宋 劉翰《開寶本草》載"胡桃（即核桃)味甘、平、無毒。食之令人肥健，潤肌黑發(fā)，取瓤燒令黑，未 斷煙，和松脂，研傅瘰疬瘡"。唐化孟詵《食療本草》中說，核桃仁能"通經(jīng)脈、黑須發(fā)，常服骨 肉細膩光潤"。崔禹錫的《食經(jīng)》說它"多食利小便，去五痔"?！夺t(yī)林纂要》一書的評價是，可以 "補腎，潤命門，固精，潤大腸，通熱秘，止寒瀉虛瀉。"等等。
[0003] 核桃中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)成分，含量比較均衡，屬于比較理想的高蛋 白、高脂肪的食物，據(jù)報道，核桃仁中含有高達52%_70%的油脂，其中大部分為不飽和脂肪 酸，另外還含有約24%的蛋白質(zhì)，
[0004] 12 % -16 %的碳水化合物，1.5 % -2 %的纖維素，以及1.7 % -2 %的礦物質(zhì)。核桃中 富含人體必需的氨基酸，且氨基酸比例比較合理，其中對人體生理作用有著重要功能的谷 氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量均較高，其中谷氨酸還是影響人體特別是青少年智力及記憶發(fā) 育的重要功能物質(zhì)。
[0005] 為了獲得比核桃原蛋白在營養(yǎng)、功能性及生物活性上更加優(yōu)良的低聚肽粉，已嘗 試了多種制備方法。專利CN 101228918A將核桃柏粉碎，超聲波法提取核桃蛋白，將核桃蛋 白真空干燥后，再使用蛋白酶進行酶解，離心，使用透析袋對上清液進行透析，經(jīng)濃縮透析 液并真空干燥得到含量在60 %~80 %的肽粉。該方法操作復(fù)雜，肽含量較低，肽分子量的分 布也不明確，同時使用超聲提取蛋白，透析袋進行精致，無法進行大規(guī)模制備。專利CN 102406050A使用堿提酸沉方法提取蛋白質(zhì)，經(jīng)冷凍干燥得到核桃蛋白粉，蛋白粉經(jīng)酶解后， 用300Mpa高壓處理lOmin，冷凍干燥得核桃肽粉。此制備方法需超高壓設(shè)備和冷凍干燥機， 成本高，不適宜大規(guī)模生產(chǎn);該發(fā)明專利雖然提供了該法制備的核桃肽粉的分子量分布，但 產(chǎn)品中肽含量不明確。專利CN 103103244B使用堿提酸沉的方法提取蛋白質(zhì)，并用微波結(jié)合 超聲波處理后，酶解得到多肽粉。該法仍不適用大規(guī)模生產(chǎn)，并且沒有對酶解產(chǎn)品中肽含量 進行測定。專利CN 104293870A先使用C〇2超臨界萃取儀去除油脂后得到的核桃柏，喊提酸 沉后噴霧得到核桃蛋白粉，再將蛋白粉制成懸濁液并煮沸破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使用堿性蛋 白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶分段四步酶解核桃蛋白液，經(jīng)5000Dal ton或者 SOOODalton超濾膜精制后使用離子交換樹脂脫鹽，最后噴霧干燥得到核桃肽粉。此專利涉 及到去除油脂時使用超臨界萃取儀，增加成本，不易于大生產(chǎn);涉及到4種酶分段四步酶解， 步驟繁瑣、成本高;涉及到酶解完成后，未經(jīng)過微濾膜除雜，直接進行超濾膜，造成超濾膜易 阻塞，超濾時間延長，降低多肽收率，同時縮短超濾膜使用壽命;此專利未涉及到多肽產(chǎn)品 中
[0006] 肽的百分含量和肽的分子量分布。
[0007] 可見，以上核桃多肽的制備條件苛刻，工藝步驟繁瑣，很難實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，因此 尋找一套工藝簡單、低成本、高含量、較高活性的核桃多肽的制備方法已經(jīng)成為尋找大規(guī)模 生產(chǎn)的研究熱點之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供了一種高純度、低分子量的核桃低聚肽粉。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供了一種高純度、低分子量的核桃低聚肽粉的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明核桃低聚肽粉用于制備治療或預(yù)防自由基過 多引起的癥狀的藥物、食品或保健品的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供了含有本發(fā)明核桃低聚肽粉的藥物和食品組合物。
[0012] 本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0013] 一種核桃低聚肽粉，采用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量 在80wt%以上，其中95%以上核桃肽的分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下：
[0014]
[0015] 數(shù)均分子量范圍：170~3000
[0016] 重均分子量范圍：180~4000
[0017] 所述核桃低聚肽粉是通過下述方法制備得到的：
[0018] (1)核桃柏的預(yù)處理:將核桃去殼、冷榨脫油，得到脫脂核桃柏。
[0019] (2)逆流提取法提取蛋白質(zhì)：將一定量脫脂后的核桃柏（記錄為A)，與水按重量比 為1:5~1:15混合，調(diào)節(jié)pH至9~11于室溫提取1~2h;提取完成后，過濾，濾渣進行二次提 取，濾液倒入等量的核桃柏(記錄為B)，調(diào)節(jié)pH至9~11于室溫提取1~2h;B完成第一次提取 后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進行第二次提取;A完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的核 桃柏(記錄為C)，調(diào)節(jié)pH至9~11于室溫提取1~2h;B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C 完成第一次提取的濾渣中提取1~2h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取 后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為3~5，靜置0.5~2h，棄去上清 液，最后往沉淀物中加入體積比為1:10~1:20的水，攪拌均勻。
[0020] (3)蛋白酶解:將上述核桃蛋白液加熱至40~55°C，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入核桃 柏重量的0.5~2%中性蛋白酶(酶活力為30萬u/g)或者加入0.5~2%復(fù)合酶（中性蛋白酶 與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1:1，木瓜蛋白酶的活力為50萬u/g)，攪拌酶解3~6h后，煮沸滅活 30min，離心，上清液即為蛋白酶解液。
[0021] (4)分離純化:將蛋白酶解液使用孔徑為0.1~0.5μπι的微濾膜進行過濾，透過液再 經(jīng)2000~20000Dalton超濾膜處理后，截留液在50~80°C下濃縮至固含為3~5wt%時，進行 噴霧干燥，進口溫度為140~160°C，出口溫度為55~65°C，得到高純度、低分子量的淡黃色 核桃肽粉，產(chǎn)率可達20~30wt %。
[0022] (5)肽含量與分子量分布測定:采用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法， 測得肽含量在80wt%以上，其中95%以上的核桃肽的分子量小于1500Dalton。
[0023] -種組合物，其含有本發(fā)明所述的核桃低聚肽粉和，藥物或食品上可接受的助劑。
[0024] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明可將所述的組合物制備成任意所述劑型，如，素片、薄膜包 衣片、糖衣片、腸衣片、分散片、膠囊、顆粒劑、口服溶液或口服混懸液。
[0025] 本發(fā)明所述的核桃低聚肽粉可用于制備治療或預(yù)防自由基過多引起的癥狀的藥 物、食品或保健品。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0027] (1)本發(fā)明將核桃冷榨脫脂制備核桃柏，發(fā)明人做了相關(guān)實驗，與熱榨方法相比， 冷榨后蛋白質(zhì)提取率高出5wt%左右，同時含量高出20wt%左右。
[0028] (2)本發(fā)明使用高效逆流法提取核桃蛋白，相比普通的堿提酸沉法，蛋白質(zhì)的提取 率提高了 10%以上，同時減少了用水量，節(jié)約生產(chǎn)成本。
[0029] (3)本發(fā)明僅使用蛋白復(fù)溶液進行酶解，沒有將蛋白進行干燥，這樣不僅減少了蛋 白質(zhì)干燥時的損失，也簡化了制備工藝。
[0030] (4)本發(fā)明使用中性蛋白酶或者中性木瓜復(fù)合酶進行酶解，單酶或者復(fù)合酶均能 在含量、分子量、產(chǎn)率、活性上得到保證，酶解工藝穩(wěn)定，兩種酶均為食用酶，來源廣泛、成本 低，酶解時，添加量僅為核桃柏質(zhì)量的1~2 %。
[0031] (5)本發(fā)明使用微濾膜進行過濾，初步去除酶解液中的不溶物，再使用2000~ 20000Dalton超濾膜去除大分子量蛋白和肽。
[0032] (6)本發(fā)明沒有使用冷凍干燥或者真空干燥法制備產(chǎn)品，使用噴霧干燥法不僅節(jié) 約了干燥時間，而且產(chǎn)品質(zhì)粒均勻。
[0033] (7)本發(fā)明根據(jù)GB/T 22492-2008附錄A測定多肽的分子量分布，根據(jù)附錄B先測定 酸溶性蛋白和游離氨基酸的含量，最后差值即為肽含量。此分子量和肽含量的測定方法認 可度高。
[0034]
[0035]
[0036] 數(shù)均分子量范圍：170~3000
[0037] 重均分子量范圍：180~4000
[0038] (8)本發(fā)明測得肽含量在80wt %以上，其其中95 %以上的核桃肽的分子量小于 1500Da 1 ton，是高純度、低分子量的低聚肽。此外，使用自由基清除法(DPPH、ABTS)和超氧陰 離子自由基清除法(SRSA)三種方法測得此核桃低聚肽均有較好的抗氧化活性。本發(fā)明核桃 多肽的制備過程中，經(jīng)中性蛋白酶或中性木瓜復(fù)合酶酶解制得，不同酶酶解得到不同分子 結(jié)構(gòu)的多肽，因此對核桃多肽進行了抗氧化實驗從而得到驗證。
【附圖說明】
[0039] 圖1:中性蛋白酶酶解后肽液相色譜圖；
[0040] 圖2:中性木瓜蛋白復(fù)合酶酶解后肽液相色譜圖。 實施例
[0041] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實施例所述方法 僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方 法的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例中用到的所有原料和溶劑均購自 Sigma Biochemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic Clinical Reagents 公司。
[0042] 制備實施例1:
[0043] 將100kg冷榨脫脂后的核桃柏（記錄為A)，與水按重量比為1:10混合，調(diào)節(jié)pH至10 于室溫提取2h;提取完成后，過濾，濾渣進行二次提取，濾液倒入等量的核桃柏(記錄為B)， 調(diào)節(jié)pH至10于室溫提取2h;B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進行第二次提取;A完 成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃柏(記錄為C)，調(diào)節(jié)pH至10于室溫提取2h;B 完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取2h，而C第一次提取的 濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH 為5,靜置6h，棄去上清液，最后往沉淀物中加入體積比為1:10的水，攪拌均勻。將上述核桃 蛋白液加熱至45°C，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入lkg中性蛋白酶(酶活力為30萬u/g)，攪拌酶解 6h后，煮沸滅活30min，離心，上清液即為蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為Ο.?μπι的微 濾膜進行過濾，透過液再經(jīng)50000 &1切11超濾膜處理后，截留液在80°〇下濃縮至固含為3.4% 時，進行噴霧干燥，進口溫度為140°C，出口溫度為55~65°C，得到高純度、低分子量的淡黃 色核桃肽粉，產(chǎn)率為21wt%。采用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量 為81