wt%，小于1500Dalton分子量占97%。中性蛋白酶酶解后肽含量結(jié)果如下所示：
[0044] 測試結(jié)果：
[0045]
[0046] 制備實施例2:
[0047] 將100kg冷榨脫脂后的核桃柏（記錄為A)，與水按重量比為1:10混合，調(diào)節(jié)pH至10 于室溫提取2h;提取完成后，過濾，濾渣進行二次提取，濾液倒入等量的核桃柏(記錄為B)， 調(diào)節(jié)pH至10于室溫提取2h;B完成第一次提取后，濾液待用，濾渣繼續(xù)進行第二次提取;A完 成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃柏(記錄為C)，調(diào)節(jié)pH至10于室溫提取2h;B 完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取2h，而C第一次提取的 濾液待用；樣品C完成第二次提取后，濾渣棄去，濾液待用；最后合并以上待用濾液，調(diào)節(jié)pH 為5,靜置6h，棄去上清液，最后往沉淀物中加入體積比為1:10的水，攪拌均勻。將上述核桃 蛋白液加熱至45°C，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入核桃柏重量的lkg中性木瓜復(fù)合蛋白酶(兩種 蛋白酶的質(zhì)量比為1:1，中性蛋白酶的活力為30萬u/g，木瓜蛋白酶的活力為50萬u/g)，攪拌 酶解6h后，煮沸滅活30min，離心，上清液即為蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為0 . Ιμπι 的微濾膜進行過濾，透過液再經(jīng)5000Dalton超濾膜處理后，截留液在80°C下濃縮至固含為 4.1 %時，進行噴霧干燥，進口溫度為140°C，出口溫度為55~65°C，得到高純度、低分子量的 淡黃色核桃肽粉，產(chǎn)率為21wt%。采用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽 含量為81.3wt %，小于1500Dalton分子量占96 %。中性木瓜蛋白復(fù)合酶酶解后肽含量結(jié)果 如下所示：
[0048]測試結(jié)果：
[0049]
[0050] 生物活性實施例：
[0051 ] 1.DPPH自由基清除實驗：
[0052] 1. 1DPPH乙醇溶液的配制：精密稱取DPPH 4mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL 乙醇，超聲30s，用乙醇定容至刻度，搖勾，待用。本品須現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0053] 1.2供試品溶液的配制：精密稱取核桃低聚肽粉10mg，置于50mL棕色容量瓶中，加 入30mL乙醇，超聲5min，用乙醇定容至刻度，搖勾，即得。
[0054] 1.3操作步驟:準(zhǔn)確吸取2mL供試品溶液和2mL DPPH溶液混合均勻;準(zhǔn)確吸取2mL供 試品溶液和2mL乙醇混合均勻;準(zhǔn)確吸取2mLDPPH溶液和2mL乙醇混合均勻，室溫放置30min， 在515nm波長處測定吸光度，并根據(jù)以下計算公式計算自由基清除率：
[0055] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100% ；
[0056] 其中，Ai表示待測溶液和DPPH混合后溶液的吸光度；
[0057] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0058] A0表示DPPH和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0059] 2.ABTS+自由基清除實驗：
[0060] 2.1PBS緩沖液的配制:稱取氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.24g，十二水合磷 酸氫二鈉3.62g，置于lOOOmL燒杯中，加入800mL蒸餾水，攪伴使其溶解，用鹽酸或氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH至7.4，轉(zhuǎn)移至lOOOmL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。
[0061] 2.2ABTS+貯存溶液的配制:精密稱取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入 15mL蒸餾水，超聲5min，用蒸餾水定容至刻度，搖勾。精密稱取過硫酸鉀76mg左右，置于2mL 棕色容量瓶中，加入lmL蒸餾水，超聲使其溶解，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。精確吸取352yL 過硫酸鉀溶液加入至ABTS溶液中，搖勻，靜置過夜。
[0062] 2.3ABTS+工作溶液的配制：精確吸取貯存溶液lmL，加入65mL左右PBS緩沖液，搖 勻。
[0063] 2.4供試品溶液的配制：精密稱取核桃低聚肽粉20mg，置于20mL棕色容量瓶中，加 入15mL PBS緩沖液，超聲5min，用PBS緩沖液定容至刻度，搖勻，即得。
[0064] 2.5操作步驟:準(zhǔn)確吸取0.5mL供試品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均勻；準(zhǔn)確吸 取0.5mL供試品溶液和5mL PBS緩沖液混合均勻；準(zhǔn)確吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS 緩沖液混合均勻，立即在734nm處測定吸光度，并根據(jù)以下公式計算自由基清除率：
[0065] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100% ；
[0066] 其中，Ai表示待測溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
[0067] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0068] A0表示ABTS和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0069] 3.SRSA超氧陰離子自由基清除實驗：
[0070] 3.1 0.1moL/L PBS緩沖液(pH7.4)的配制:稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸二氫鉀 2.4g，三水合磷酸氫二鉀23. lg，置于1000mL燒杯中，加入600mL蒸餾水，攪伴使其溶解，用鹽 酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。 [0071] 3.2 150ymoL/L NBT溶液的配制：準(zhǔn)確稱取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中， 加入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0072] 3.3 60ymoL/L PMS溶液的配制:準(zhǔn)確稱取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加 入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0073] 3.4 468ymoL/L NADH溶液的配制:準(zhǔn)確稱取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中， 加入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0074] 3.5供試品溶液的配制:配制lmg/mL的核桃低聚肽粉，待測。
[0075] 3.6工作液的配制:取lmL 0.1moL/L PBS緩沖液(ρΗ7·4)于容量瓶中，加入lmL 150 ymoL/L NBT溶液，加入2mL 468ymoL/L NADH溶液，加入lmL 60ymoL/L PMS溶液，攪拌均勻， 25°C下反應(yīng)5min，與560nm波長處測定其吸光度值。
[0076] 3.7操作步驟:準(zhǔn)確吸取0.5mL供試品溶液和5mL上述工作溶液混合均勻;準(zhǔn)確吸取 0.5mL供試品溶液和5mL蒸餾水混合均勻;準(zhǔn)確吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸餾水混合均 勻，立即在560nm處測定吸光度，并根據(jù)以下公式計算自由基清除率：
[0077] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100%；
[0078] 其中，Ai表示待測溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
[0079] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0080] A0表示SRSA和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0081 ]分別配制制備實施例1中的中性蛋白酶解產(chǎn)品和制備實施例2中的中性木瓜復(fù)合 酶產(chǎn)品濃度為l〇〇yg/mL，以維生素 C為陽性對照(濃度為lOOyg/mL)，測試結(jié)果如表1所示： [0082]表1核桃低聚肽粉抗氧化活性
[0083]
[0084] 由表1可知，兩種酶解所得的核桃低聚肽均有較好的抗氧化活性，在相同濃度下中 性蛋白酶的酶解產(chǎn)品的抗氧化活性稍高于復(fù)合酶的酶解產(chǎn)品，這可能是由于復(fù)合蛋白酶能 酶解核桃蛋白成更多抗氧化基團的肽，但總體來看，兩者抗氧化活性相差不大。可見，核桃 低聚肽粉有可能防止人體中細(xì)胞老化、改善記憶力、延緩衰老、保護心血管、防止老年癡呆 等作用，更深層的生物活性正在研究之中。
【主權(quán)項】
1. 一種核桃低聚膚粉，其特征在于:采用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法， 測得膚含量在80wt%W上，其中95%W上核桃膚的分子量小于150(H)alton，其分子量分布 如下：2. 權(quán)利要求1所述核桃低聚膚粉的制備方法，其特征包括下述步驟:將冷棒脫脂后的核 桃巧，使用高效逆流提取法提取蛋白質(zhì)，過濾、酶解，再將蛋白酶解液依次經(jīng)過微濾膜與超 濾膜高效分離純化，最后濃縮噴霧，得到核桃低聚膚粉。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于包括下述步驟： 核桃巧的預(yù)處理:將核桃去殼、冷棒脫油，得到脫脂核桃巧； 高效逆流提取法提取蛋白質(zhì):將一定量脫脂后的核桃巧，記錄為A，與水按重量比為1: 5 ~1:15混合，調(diào)節(jié)抑至9~11于室溫提取1~化;提取完成后，過濾，濾渣進行二次提取，濾液 倒入等量的核桃椎，記錄為B，調(diào)節(jié)抑至9~11于室溫提取1~化;B完成第一次提取后，濾液 待用，濾渣繼續(xù)進行第二次提取;A完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃巧，記 錄為C，調(diào)節(jié)抑至9~11于室溫提取1~化;B完成二次提取后，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一 次提取的濾渣中提取1~化，而C第一次提取的濾液待用;樣品C完成第二次提取后，濾渣棄 去，濾液待用；最后合并W上待用濾液，調(diào)節(jié)pH為3~5，靜置0.5~化，棄去上清液，最后往沉 淀物中加入體積比為1:10~1:20的水，攬拌均勻，得到核桃蛋白液； 蛋白酶解:將上述核桃蛋白液加熱至40~55°C，將pH值調(diào)節(jié)至中性，加入核桃巧重量 0.5~2%的，酶活力為30萬u/g的中性蛋白酶或者加入0.5~2%復(fù)合酶，所述復(fù)合酶的中性 蛋白酶與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1:1，木瓜蛋白酶的活力為50萬u/g;攬拌酶解3~化后，煮 沸滅活30min，離屯、，上清液即為蛋白酶解液。 分離純化:將蛋白酶解液使用孔徑為0.1~0.5WI1的微濾膜進行過濾，透過液再經(jīng)2000 ~20000Dalton超濾膜處理后，截留液在50~80°C下濃縮至固含為3~5wt%時，進行噴霧干 燥，進口溫度為140~160°C，出口溫度為55~65°C，得到核桃低聚膚粉，產(chǎn)率20~30wt%。4. 一種組合物，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的核桃低聚膚粉和，藥物或食品上可 接受的助劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于：其劑型選自素片、薄膜包衣片、糖衣片、 腸衣片、分散片、膠囊、顆粒劑、口服溶液或口服混懸液。6.權(quán)利要求1所述的核桃低聚膚粉用于制備治療或預(yù)防自由基過多引起的癥狀的藥 物、食品或保健品的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種核桃低聚肽粉及其制備方法和用途，所述低聚肽粉肽含量在80wt％以上，其中95％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton。所述方法包括使用高效逆流提取法提取核桃蛋白，過濾、酶解，再將蛋白酶解液依次經(jīng)過微濾膜與超濾膜高效分離純化，最后濃縮噴霧，得到低聚肽粉。本發(fā)明的方法操作簡便，高收率低成本，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，工藝綠色環(huán)保，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
【IPC分類】C12P21/06, A61K38/02, C07K1/14, C07K1/34, A23L33/185, A61P39/06
【公開號】CN105567774
【申請?zhí)枴緾N201610043952
【發(fā)明人】王昭日, 劉明川, 楊勝杰, 洪達, 楊進平, 凌赟, 黃佳慧
【申請人】杏輝天力（杭州）藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月22日