用于快速檢測食用向日葵雜交種sh363真實性的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于鑒定農作物種子真實性和品種純度領域，具體涉及一種基于SSR分子 標記技術建立的可快速檢測向日葵雜交種SH363真實性的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 向日葵（Helianthus annuusL.)屬菊科（Composicae)向日葵屬的雙子葉植物，原 產自北美，通過人工培育形成了具有很多不同遺傳多態(tài)性的品種，具有耐鹽堿、耐干旱、耐 瘠薄、適應性強的特點，含油量豐富，油脂中亞油酸含量高，是世界第二大油科作物。向日葵 的品種繁多，其中食用向日葵由于不飽和脂肪酸含量高，尤其是亞油酸和α-麥胚酚（維生 素 Ε的一種）含量高，不僅營養(yǎng)豐富，還可有效防治心血管疾病，廣受人們喜愛。食用向日 葵品種豐富，有數百個地方品種散步在全國各地。隨著向日葵育種技術的不斷發(fā)展和雜交 品種的廣泛推廣，開發(fā)出了更多的具有優(yōu)勢的食用向日葵雜交種，但由于食用向日葵品種 的繁多以及不法商販販賣偽劣假冒的食用向日葵品種，使得食用向日葵雜交種的保護受到 嚴重的破壞，損害了廣大的種植戶的利益，因此食用向日葵雜交種的真實性與品種純度鑒 定已越來越成為食用向日葵新品種保護以及保護種植戶利益的必要手段。
[0003] 傳統(tǒng)的向日葵雜交種的真實性與品種純度鑒定方法依靠田間小區(qū)鑒定方法，在苗 期、蕾期、花期、灌漿期以及對收獲后的種子等進行觀測鑒定，主要依據向日葵的株、葉、花、 種子的特征特性加以評價和判斷。但上述鑒定方法存在如下缺陷：（1)受到經驗的限制， 沒有完全一致的評判標準；（2)在向日葵生長期間的鑒定還容易受到氣候與栽培條件的影 響，引起誤差或誤判；(3)需投入大量的人力、物力，成本高、耗時長，時效性差，對市場與生 產的指導不及時，難以避免給生產上帶來的損失。
[0004] 隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子標記技術越來越多的應用于農作物種子的真實 性與品種純度鑒定。分子標記技術作為一種植物基因組特征分析手段，是繼形態(tài)標記、細胞 標記和生化標記之后發(fā)展出的一種新的較理想的基因標記形式。分子標記鑒定技術是以 DNA分子多態(tài)性為基礎的一種遺傳標記，能穩(wěn)定遺傳，可以反映生物的個體和群體特征。由 于分子標記可以直接反映 DNA水平上的差異，具有高度的專一性和特異性，可以用于鑒定 種子的真實性與品種純度。
[0005] SSR(simple sequence repeats)是一種常用的標記技術，具有數量豐富、多態(tài)性 高、共顯性遺傳、擴增穩(wěn)定、易于檢測等方面的優(yōu)點，已在許多農作物遺傳連鎖圖譜的構建、 遺傳多樣性、標記和定位基因以及分子標記輔助方面的應用。SSR技術是基于微衛(wèi)星DNA， 其是一段核酸簡單重復序列，廣泛存在于真核生物的基因組中，微衛(wèi)星DNA重復單位的重 復次數出現不同，在不同基因型間同一基因座位的微衛(wèi)星DNA往往表現為長度等的差異， 形成了豐富的多態(tài)性。SSR的核心單位一般由2-6個核苷酸組成，兩側一般是保守序列， 可以根據微衛(wèi)星兩端的單拷貝序列設計特異性引物，利用PCR技術擴增每個位點的微衛(wèi)星 DNA序列，通過電泳分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，進而達到區(qū)別不同品種的目的。微衛(wèi)星標記通 常具有共顯性的特點，F1雜交種具有雙親等位基因的互補帶型。鑒于不育系和其同型保持 性遺傳背景基本一致，只在不育基因、保持基因等特征基因上存在差異，據此特征基因選擇 DNA分子標記進行分析，從而實現植物品種的有效地區(qū)別和鑒定。SSR標記已成為現階段用 于鑒定種子純度的常用方法，已廣泛應用于玉米、水稻、大豆的新品種純度鑒定。但是目前 在食用向日葵雜交種使用SSR分子標記技術鑒定其真實性和純度的報道鮮有，建立一套適 于食用向日葵雜交種真實性和純度鑒定的SSR分子標記技術具有重要意義，可以克服傳統(tǒng) 的田間小區(qū)種植鑒定所帶來的不足。
[0006] SH363是北京三瑞農業(yè)科技有限公司2010年選育的食用向日葵晚熟雜交種，其親 本組合為A436XR1843,生育期為115-125天；幼苗綠莖，生長整齊，長勢旺；葉片平展，卵圓 形，葉片數30片左右，葉色深綠，葉片大，株型整齊清秀。開花期一致，舌狀花黃色?；ūP 直徑20厘米左右，植株彎曲度較大，株高220厘米左右，莖桿粗壯韌性極好，抗倒伏能力極 強；平均單盤粒數多，結實率85 %左右，粒長2. 0-2. 3厘米，千粒重185g左右；籽粒為黑色 白邊有不規(guī)則白色條紋，潔凈，口感香甜，商品性極好，籽粒飽滿，籽仁率可達到50-55%。 該品種成熟時葉片干凈，抗霜霉病，抗黃萎??；菌核病的發(fā)生率很低。該品種產量三要素協(xié) 調，豐產性良好，一般畝產340公斤左右。適合中高肥力的田塊種植。田間表現整齊，高抗 病，抗倒伏，耐鹽堿。為保證該優(yōu)質品種的最大經濟效益及其產業(yè)化的發(fā)展，需要一種可高 效準確的檢測試劑盒來快速鑒定所述食用向日葵雜交種SH363的真實性和品種純度，加快 雜交種的質量檢測進程。

【發(fā)明內容】

[0007] 為此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種可快速鑒定食用向日葵雜交種 SH363真實性的試劑盒，所述試劑盒使用方便、快捷，能夠在短時間內對大量的待測食用向 日葵雜交種SH363樣品進行快速鑒定，測定結果準確穩(wěn)定可靠。
[0008] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測食用向日葵雜交種SH363 真實性的試劑盒，所述試劑盒包括各自獨立包裝的引物液、PCR反應液和DNA聚合酶部分， 其中，所述引物液部分含有如下引物SR-366、引物SR-495、引物SR-1067和引物SR-1079中 的至少一種：
[0009] SR-366-F: 5，-AACCAACTGAGCATTCTTGTGA-3，，
[0010] SR-366-R: 5，-GCGCTAGGTTAAAGAGGACAAA-3，；
[0011] SR-495-F: 5 ' -CCAGGATTAGGTAGCTTAGTTCG-3 '，
[0012] SR-495-R: 5 ' -GCGATCTGAGGTTGACTCGT-3 ' ；
[0013] SR-1067-F: 5 ' -CGTCAACTAATGCTGTCCTGATG-3 '，
[0014] SR-1067-R:5,-TCGGATATGATGCTGCTAAAGGT-3,；
[0015] SR-1079-F: 5 ' -TACGACTGACGATTCCATTTCTC-3 '，
[0016] SR-1079-R: 5' -AACTGGATTTCACAGGGAGTGTT-3'。
[0017] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的試劑盒，其特征在于，所 述引物液部分中的引物為引物SR-366、引物SR-495、引物SR-1067和引物SR-1079中的任 意兩種。
[0018] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的試劑盒，所述PCR反應液 部分含有用于進行PCR擴增的含Mg2+擴增緩沖液、dNTPs以及ddH20。
[0019] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的試劑盒，所述DNA聚合酶 為Taq DNA聚合酶。
[0020] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的試劑盒，每支所述試劑盒 的配方為：
[0021] 引物液，0·2μΜ，1μL;
[0022] Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ;
[0023] 10 X 含 Mg2+ 擴增緩沖液，2mM，2· 5 μ L ;
[0024] dNTPs, 2. 5mM, 2 μ L ；
[0025] ddH20,17μ L〇
[0026] 本發(fā)明提供了一種利用所述試劑盒快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的 方法，包括如下步驟，
[0027] (1)分別取由待測食用向日葵雜交種SH363、以及標準向日葵種子A436和R1843 種植得到的向日葵真葉為材料，利用常規(guī)CTAB法提取上述各食用向日葵的基因組DNA ;
[0028] (2)取步驟⑴獲得的基因組DNA為模板，利用權利要求1-5任一所述的試劑盒分 別對各所述基因組DNA進行PCR擴增；
[0029] (3)分別將步驟（2)獲得的各樣本PCR擴增產物進行凝膠電泳處理，獲得所述待測 食用向日葵雜交種SH363以及其親本標準向日葵A436和R1843的電泳圖譜；
[0030] (4)對比上述雜交種SH363以及其親本標準種子A436和R1843的電泳圖譜，若所 述雜交種SH363同時具有其親本標準種子A436和R1843的特征譜帶，則判定所述待測食用 向日葵雜交種SH363為真實；反之，為假。
[0031] 所述的快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的方法，所述DNA模板的加入量 為30ng配制1 μ L。
[0032] 所述的快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的方法，所述步驟（2)中，PCR擴 增程序如下：95°C預變性2min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，之后每個循環(huán)退 火溫度下降1°C，直至54°C，94°C變性30s，54退火30s，72°C延伸30s，進行30個循環(huán)，最終 72°C延伸20min，獲得的擴增產物4°C保存，備用。
[0033] 本發(fā)明提供了一種所述的試劑盒在鑒定優(yōu)質食用向日葵雜交種SH363真實性領 域中的用途。
[0034] 本發(fā)明提供了一種所述的快速檢測優(yōu)質食用向日葵雜交種SH363的方法在鑒定 食用向日葵雜交種SH363真實性領域中的用途。
[0035] 本發(fā)明的上述技術方案相比現有技術具有以下優(yōu)點：
[0036] (1)本發(fā)明所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的試劑盒，通過 大量引物篩選研究，篩選出了引物SR-366、引物SR-495、引物SR-1067和引物SR-1079，使用 上述引物中的至少一種對待測食用向日葵雜交種SH363進行品種的鑒定，電泳圖譜清晰， 在短時間內進行大量的食用向日葵雜交種SH363的品種鑒定，鑒定結果穩(wěn)定、準確可靠； [0037] (2)本發(fā)明所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH363真實性的試劑盒，操作 步驟簡單、易操作，可以高效的對食用向日葵雜交種SH363的品種鑒定，檢測結果準確。
【附圖說明】
[0038] 為了使本發(fā)明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發(fā)明的具體實施例并結合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中
[0039] 圖1是本發(fā)明實施例1的食用向日葵雜交種SH363的電泳圖譜；
[0040] 圖2是本發(fā)明實施例2的食用向日葵雜交種SH363的電泳圖譜；
[0041] 圖3是本發(fā)明實施例3的食用向日葵雜交種SH363的電泳圖譜；
[0042] 圖4是本發(fā)明實施例4的食用向日葵雜交種SH363的電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明所使用的主要試劑如下：
[0044] RNase A生產廠家為北京全式金生物技術有限公司，型號為GE101 ;
[0045] GelSafe核酸染料生產廠家為北京原平皓生物技術有限公司，型號為EP106-01 ;
[0046] 所使用的SSR引物生產廠家為生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0047] EasyTap Buffer for PAGE生產廠家為北京全式金生物技術有限公司，型號為 API12-02 ；
[0048] dNTPs生產廠家為北京全式金生物技術有限公司，型號為API 12-02 ;
[0049] EasyTap DNA Polymerase for PAGE生產廠家為北京全式金生物技術有限公司、型 號為 AP112-02 ;
[0050] TEMED生產廠家為SIGMA，型號為T8133 ;
[0051] 本發(fā)明所使用的主要