，所述凝膠電 泳包括如下步驟：
[0115] 所述凝膠電泳體系包括：
[0116] 尿素（Urea)，420g ;
[0117] 5XTBE, 100mL ；
[0118] 丙烯酰胺，57g
[0119] N、N' -亞甲基雙丙烯酰胺，3g ;
[0120] ddH20，lL;
[0121] A)配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系 取Urea、5XTBE、丙烯酰胺、Ν、Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺和ddH20混合均勻制成膠混合液， 4°C保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度為10%的APS(催化劑）和 TEMED(加速劑）（對(duì)于20cmxl7cm的玻璃板，除去板條尺寸，膠為16. 5cm (寬）xl5. 5cm (高） xlmm(厚），對(duì)于1板膠，膠混合液30mL，10% APS為180 μ L，TEMED為80 μ L，對(duì)于2板膠， 膠混合液60mL，10 % APS為360 μ L，TEMED為160 μ L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致 的梳子，同時(shí)避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水 稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定在電泳槽上，電泳槽中加入適量IXΤΒΕ電泳 緩沖液（緩沖液可重復(fù)使用6-7次），在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下預(yù)電泳lh，使 凝膠預(yù)熱；
[0122] B)取步驟⑵獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入10 μ L的1 X上樣緩沖液（Loading dye) 中混合均勻，95°C變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 μ L，于恒定電壓300V，電 流50mA-60mA下電泳lh，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約lcm時(shí)，停止電泳，取出膠板，用 ddH20沖洗干凈后，經(jīng)3XGelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在 波長(zhǎng)為302nm紫外光激發(fā)下并拍照。
[0123] (4)對(duì)比上述雜交種SH363以及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R1843的電泳圖譜，如圖 2所示，Μ為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pp P2為食用向日葵雜交種SH363的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和 R1843, F1為食用向日葵雜交種SH363,從圖中可以看到所述待測(cè)食用向日葵雜交種SH363 同時(shí)具有其雙親特征譜帶，則所述待測(cè)食用向日葵雜交種SH363為真實(shí)的。
[0124] 實(shí)施例3
[0125] 本實(shí)施例所述用于快速檢測(cè)食用向日葵雜交種SH363真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0126] 所述引物液部分中的引物為引物SR-1067,所述SR-1067引物：
[0127] SR-1067-F: 5 ' -CGTCAACTAATGCTGTCCTGATG-3 '，
[0128] SR-1067-R: 5, -TCGGATATGATGCTGCTAAAGGT-3,。
[0129] 每支所述試劑盒的配方為：
[0130] 引物液，0·2μΜ，1μL;
[0131] Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ;
[0132] 10 X 含 Mg2+ 擴(kuò)增緩沖液，2mM，2· 5 μ L ;
[0133] dNTPs,2. 5mM, 2 μ L ；
[0134] ddH20,17μ L〇
[0135] 利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實(shí)性的方法，包括如下步 驟：
[0136] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種SH363及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R1843種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[0137] a)取所述食用向日葵真葉10mg (約lcm2)置于裝有研磨株的2mL離心管中，置于 液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過(guò)的離心管置于研磨器中在30Hz條件下研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn) 移所述離心管于液氮中待用；
[0138] b)取出步驟a)的離心管并加入1000 μ L預(yù)熱過(guò)的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和巰基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每lOmin取出所述離 心管上下顛倒混勻一次；
[0139] c)將步驟b)反應(yīng)后的離心管放入4°C離心機(jī)中，于12000rpm下離心10min后，吸 取上清600 μ L并加入等體積的由體積比為1:1的三氯甲烷和Tris飽和酚構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離心機(jī)中，于12000rpm離心15min后，吸取上清500 μ L至2mL離心管 中，備用；
[0140] d)向步驟c)中的所述離心管中加入等體積三氯甲烷混勻，靜置3min后，放入4°C 離心機(jī)，12000rpm離心10min，吸取上清300 μ L至1. 5mL離心管中，備用；
[0141] e)向步驟d)中的所述離心管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離心機(jī)，7500rpm離心7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入lmL質(zhì)量濃度為75 %的乙 醇，搖晃離心管，充分洗滌所述沉淀，然后放入4°C離心機(jī)，7500rpm離心7min，棄去上清液， 晾干沉淀；
[0142] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 μ L的無(wú)菌ddH20溶解DNA，再加入 1 μ L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0143] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進(jìn)行定量檢測(cè)和/或質(zhì)量檢測(cè)：
[0144] 所述定量檢測(cè)步驟具體包括：取DNA樣品2 μ L用ddH20稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測(cè)定0D26Q、0D2S。，并計(jì)算0D 26Q/0D2S。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0145] 所述質(zhì)量檢測(cè)步驟具體包括：取1 μ L樣品DNA，在濃度為0. 7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行 電泳30min，用lOOOOXGelSafe染液染色并凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且 可用；若無(wú)帶出現(xiàn)，帶型彌散，則表明DNA已降解不可用；
[0146] (2)取步驟⑴的基因組DNA為模板，利用所述的試劑盒分別對(duì)各所述基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0147] PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性2min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個(gè)循環(huán)退火溫度下降rc，直至54°C，94°C變性30s，54退火30s，72°C延伸30s，進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)，最終72°C延伸20min，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存，備用；
[0148] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種SH363及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R1843的電泳圖譜，所述凝膠電 泳包括如下步驟：
[0149] 所述凝膠電泳體系包括：
[0150] 尿素（Urea)，420g ;
[0151] 5 X TBE, 100mL ；
[0152] 丙烯酰胺，57g
[0153] N、N' -亞甲基雙丙烯酰胺，3g ;
[0154] ddH20，lL;
[0155] A)配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系 取Urea、5XTBE、丙烯酰胺、Ν、Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺和ddH20混合均勻制成膠混合液， 4°C保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度為10 %的APS (催化劑）和 TEMED(加速劑）（對(duì)于20cmxl7cm的玻璃板，除去板條尺寸，膠為16. 5cm (寬）xl5. 5cm (高） xlmm(厚），對(duì)于1板膠，膠混合液30mL，10% APS為180 μ L，TEMED為80 μ L，對(duì)于2板膠， 膠混合液60mL，10 % APS為360 μ L，TEMED為160 μ L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致 的梳子，同時(shí)避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水 稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定在電泳槽上，電泳槽中加入適量1ΧΤΒΕ電泳 緩沖液（緩沖液可重復(fù)使用6-7次），在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下預(yù)電泳lh，使 凝膠預(yù)熱；
[0156] B)取步驟⑵獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入10 μ L的1 X上樣緩沖液（Loading dye) 中混合均勻，95°C變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 μ L，于恒定電壓300V，電 流50mA-60mA下電泳lh，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約lcm時(shí)，停止電泳，取出膠板，用 ddH20沖洗干凈后，經(jīng)3XGelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在 波長(zhǎng)為302nm紫外光激發(fā)下并拍照。
[0157] (4)對(duì)比上述雜交種SH363以及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R1843的電泳圖譜，如圖 3所示，Μ為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pp P2為食用向日葵雜交種SH363的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和 R1843, F1為食用向日葵雜交種SH363,從圖中可以看到所述待測(cè)食用向日葵雜交種SH363 同時(shí)具有其雙親特征譜帶，則所述待測(cè)食用向日葵雜交種SH363為真實(shí)的。
[0158] 實(shí)施例4
[0159] 本實(shí)施例所述用于快速檢測(cè)食用向日葵雜交種SH363真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0160] 所述引物液部分中的引物為引物SR-1079,所述SR-1079引物：
[0161] SR-1079-F: 5 ' -TACGACTGACGATTCCATTTCTC-3 '，
[0162] SR-1079-R: 5' -AACTGGATTTCACAGGGAGTGTT-3'。
[0163] 每支所述試劑盒的配方為：
[0164] 引物液，0·2μΜ，1μL;
[0165] Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ;
[0166] 10Χ 含 Mg2+ 擴(kuò)增緩沖液，2mM，2· 5 μ L ;
[0167] dNTPs, 2. 5mM, 2 μ L ；
[0168] ddH20,17μ L〇
[0169] 利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實(shí)性的方法，包括如下步 驟：
[0170] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種SH363及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R1843種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[0171] a)取所述食用向日葵真葉10mg (約lcm2)置于裝有研磨株的2mL離心管中，置于 液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過(guò)的離心管置于研磨器中在30Hz條件下研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn) 移所述離心管于液氮中待用；
[0172] b)取出步驟a)的離心管并加入1000 μ L預(yù)熱過(guò)的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和巰基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每lOmin取出所述離 心管上下顛倒混勻一次；
[0173] c)將步驟b)反應(yīng)后的離心管放入4°C離心機(jī)中，于12000rpm下離心10min后，吸 取上清600 μ L并加入等體積的由體積比為1:1的三氯甲烷和Tris飽和酚構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離心機(jī)中，于12000rpm離心15min后，吸取上清500 μ L至2mL離心管 中，備用；
[0174] d)向步驟c)中的所述離心管中加入等體積三氯甲烷混勻，靜置3min后，放入4°C 離心機(jī)，12000rpm離心10min，吸取上清300 μ L至1. 5mL離心管中，備用；
[0175] e)