包括在無飼養(yǎng)細胞(feeder cell-free)條件下培養(yǎng)誘導的多能干細胞。如果誘導的多能干細胞是穩(wěn)定化的，這些細胞可在僅用明膠涂覆的培養(yǎng)皿上于無飼養(yǎng)細胞條件下培養(yǎng)。如果所述細胞在無飼養(yǎng)細胞條件中培養(yǎng)，則本發(fā)明的組合物不存在時會發(fā)生不需要的分化，使得難以制成展示均勻形態(tài)的細胞，而本發(fā)明組合物的使用抑制了不需要的分化，使得以更穩(wěn)定和有效的方式維持誘導的多能干細胞成為可能。
[0066]作為在本發(fā)明中用于培養(yǎng)誘導的多能干細胞的培養(yǎng)基，可使用本領域已知的任何基礎培養(yǎng)基而不受限制。用于本發(fā)明的基礎培養(yǎng)基可為合成的基礎培養(yǎng)基或商業(yè)上可得到的基礎培養(yǎng)基。商業(yè)上可得到的基礎培養(yǎng)基的實例包括達爾伯克氏改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle’s medium)(DMEM)、基本必需培養(yǎng)基(MEM)、伊格爾基本培養(yǎng)基(basal medium eagle) (BME)、RPMI 1640、F-10、F_12、a-基本必需培養(yǎng)基(a_MEM)、格拉斯哥(氏)基本必需培養(yǎng)基(G-MEM)和Isocove ’ s改良的達爾伯克氏培養(yǎng)基，但不限于此。商業(yè)上可得到的基礎培養(yǎng)基可為DMEM。此外，基礎培養(yǎng)基優(yōu)選包括10 % (v/v)馬血清。在本發(fā)明的具體實例中，誘導的多能干細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0067]本發(fā)明還提供使用本發(fā)明包含小分子化合物的組合物產生誘導的多能干細胞的方法，所述誘導的多能干細胞具有與胚胎干細胞更相似的增殖和分化能力。
[0068]如上文所述，本發(fā)明涉及使用包含小分子化合物的組合物維持誘導的多能干細胞的染色體穩(wěn)定性的方法和使用包含小分子化合物的組合物培養(yǎng)誘導的多能干細胞的方法。更具體地，本發(fā)明涉及包含小分子化合物作為活性成分的組合物增加誘導的多能干細胞產生效率的新用途。根據(jù)本發(fā)明，通過將四種重編程因子(0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc)引入小鼠尾尖成纖維細胞然后在包含小分子化合物(ROCK抑制劑、MEK抑制劑、ALK5抑制劑或抗氧化劑)作為活性成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成纖維細胞而產生的誘導的多能干細胞可以快速和有效的方式產生，且還可抑制染色體突變和DNA損傷。這些結果不僅可非常有效地用于產生未來臨床應用中可使用的安全的誘導的多能干細胞，還可用于在這些細胞分化成多種功能性細胞后開發(fā)多種細胞治療劑。換言之，本發(fā)明可有效用作核心技術以開發(fā)用于細胞療法的干細胞系，其可治療多種不可治愈的疾病。
[0069]在上文的說明書中，描述集中在誘導的多能干細胞的培養(yǎng)上，但對本發(fā)明所屬領域的技術人員顯而易見的是本發(fā)明的包含小分子化合物作為活性成分的組合物具有維持多能性和抑制染色體突變或DNA損傷的效果，且可使用已知技術應用。
實施例
[0070]下文中，本發(fā)明將參照實施例進一步詳細說明。對本領域的技術人員顯而易見的是實施例僅出于說明目的而并非是對本發(fā)明保護范圍的限制。因此，本發(fā)明實質范圍將通過所附的權利要求及其等同物進行限定。
[0071]實施例1:包含用于誘導重編程的重編程因子的逆轉錄病毒的構建
[0072]為構建能夠遞送四種重編程因子(0ct4、Klf4、Sox2和cMyc)的逆轉錄病毒，使用購自Addgene的pMXs載體質粒。用于構建逆轉錄病毒的293GPG細胞培養(yǎng)于100-mm細胞培養(yǎng)皿中從而生長至約80%匯合，并使用Lipofectamin 2000( Invitrogen)根據(jù)附加的說明將質粒引入293GPG細胞。48小時后，每天收集作為細胞培養(yǎng)上清分泌的5ml的逆轉錄病毒進行兩周并在-80°C保存直至使用。逆轉錄病毒與包含2-4yg/ml Polybrene的培養(yǎng)基混合，且細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5小時以用逆轉錄病毒感染細胞并將基因遞送入細胞。
[0073]實施例2:使用包含小分子化合物的組合物產生誘導的多能干細胞
[0074]2-1:小分子化合物的組合和添加
[0075]為使用小分子化合物產生誘導的多能干細胞，將MEK抑制劑、ALK5抑制劑、ROCK抑制劑和抗氧化劑添加至培養(yǎng)基組合物，并在培養(yǎng)基組合物中培養(yǎng)細胞。具體地，作為小分子化合物，單獨或組合使用MEK抑制劑PD0325901、ALK5抑制劑SB431542、R0CK抑制劑thiazovivin和抗氧化劑L-抗壞血酸。各小分子化合物為購自生產廠家如Stemgent、Cayman和Sigma的粉末狀產品。此處，將MEK抑制劑PD0325901以0.5mM的濃度溶解于二甲基亞砜(DMSO)并作為1000倍濃縮液保存在-20°C的溫度，并將ALK5抑制劑SB431542以2mM的濃度溶解于二甲基亞砜(DMSO)并作為1000倍濃縮液保存在-20°C的溫度。將ROCK抑制劑thiazovivin以0.5mM的濃度溶解于二甲基亞砜(DMSO)并作為1000倍濃縮液保存在-20°C的溫度，并將抗氧化劑L-抗壞血酸以200mM的濃度溶解于三重蒸餾水并作為1000倍濃縮液保存在-20°C的溫度。將各小分子化合物作為添加劑在用于產生誘導的多能干細胞或維持誘導的多能干細胞的染色體穩(wěn)定性的培養(yǎng)過程中用于培養(yǎng)基。此處，培養(yǎng)基中小分子化合物的最終濃度對于ro0325901為0.5μΜ，對于SB431542為2μΜ，對于Thiazovivin為0.5μΜ，且對于L-抗壞血酸為200μΜ。
[0076]2-2:誘導的多能干細胞的產生
[0077]使用逆轉錄病毒將重編程因子引入小鼠尾尖成纖維細胞，由此獲得誘導的多能干細胞。具體地，將約50，000-100，000小鼠成纖維細胞在約2-3代培養(yǎng)于100-mm細胞培養(yǎng)皿，且培養(yǎng)后，用包含含有四種重編程因子(0ct4、Klf4、Sox2和cMyc)的質粒的逆轉錄病毒以2或更多MOI感染細胞。
[0078]用病毒感染的細胞進一步培養(yǎng)約兩天，然后用0.05%胰蛋白酶-EDTA2處理3分鐘以分離單細胞。分離的細胞培養(yǎng)在用0.1 %明膠涂覆的6-孔細胞培養(yǎng)皿上生長的飼養(yǎng)細胞上。作為飼養(yǎng)細胞，使用分裂受絲裂霉素抑制的小鼠成纖維細胞。將實施例2-1中制備的包含小分子化合物的組合物添加至用于培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)基，且由重編程因子引入的成纖維細胞在5% 二氧化碳和37°C的溫度條件下培養(yǎng)在培養(yǎng)基中。用于此實施例中的用于培養(yǎng)小鼠干細胞的基礎培養(yǎng)基組合物由補充了2mM L-谷氨酰胺、ΙΟπιΜβ-巰基乙醇、0.1mMMEM ΝΕΑΑ、500單位/ml ESGRO(LIF)、10%馬血清和抗生素Pen/strep的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基(GIBCO)組成。
[0079]2-3:誘導的多能干細胞的培養(yǎng)
[0080]培養(yǎng)約I周后，觀察到具有與胚胎干細胞相似形態(tài)的誘導的多能干細胞集落在飼養(yǎng)細胞上形成(圖lb)。為檢查形成的誘導的多能干細胞集落是否具有與胚胎干細胞相似的特性，實施了 AP染色。AP染色的結果指示觀察到誘導的多能干細胞集落，其染色為紅色且對于染色為陽性(圖lb)。根據(jù)附加的指引使用測試試劑盒(Stemgent)實施AP染色。此外，顯示本發(fā)明包含小分子化合物的組合物增加了重編程速率和效率(圖lc)。
[0081]產生的誘導的多能干細胞集落使用玻璃吸管物理分離并培養(yǎng)在新鮮的飼養(yǎng)細胞上。發(fā)現(xiàn)當誘導的多能干細胞穩(wěn)定化時，這些細胞能在僅用明膠涂覆而無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。
[0082]實施例3:通過RT-PCR和免疫熒光染色對誘導的多能干細胞多能性的確認-產生的誘導的多能干細胞的驗證
[0083]對于RT-PCR，誘導的多能干細胞用0.05 %胰蛋白酶-EDTA處理2_3分鐘以分離單細胞，且將分離的細胞離心。將沉淀轉移入1.5-ml管，且從其提取RNA。使用TRI試劑分離細胞RNA。使用逆轉錄酶和寡聚物(dT)將3yg的RNA轉化成cDNA，并通過PCR使用引物擴增感興趣的cDNA ο電穿孔PCR產物以檢查感興趣基因的表達水平。PCR的結果指示構建的誘導的多能干細胞系全部表達多能性基因，包括0ct4、Klf4、Sox2、Nanog和Rexl(圖2a)。對于免疫熒光染色，在多孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細胞用PBS洗滌，然后用4%多聚甲醛(para-formaldehyde)溶液在室溫固定I小時或在4°C過夜。固定的細胞用0.1 %Triton-X溶液處理5分鐘以穿透細胞膜，其后將細胞用10%正常驢血清封閉，然后與一抗溫育。免疫熒光染色的結果指示多能性標記物包括Oct4、Klf4、Sox2、cMyc和SSEAl在全部誘導的多能干細胞中表達(圖2b)。
[0084]實施例4:檢查誘導的多能干細胞分化能力-產生的誘導的多能干細胞的驗證
[0085]4-1:誘導的多能干細胞的分化
[0086]為檢查產生的誘導的多能干細胞的分化能力，用胰蛋白酶-EDTA處理全部細胞系以分離單細胞，然后誘導胚體(EB)的形成。為允許誘導的多能干細胞分化成為胚體(EB)，將誘導的多能干細胞在不存在抑制誘導的多能干細胞分化的LIF的情況下懸浮培養(yǎng)。具體地，培養(yǎng)的誘導的多能干細胞用PBS洗滌，然后用0.05%胰蛋白酶-EDTA處理2-3分鐘以分離單細胞。分離的細胞在用于細胞不對其粘附的細菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿中用2mM L-谷氨酰胺、ΙΟπιΜβ-疏基乙醇、0.1mM MEM NEAA、10%胎牛血清(FBS)和抗生素Pen/strep的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基(GIBCO)懸浮培養(yǎng)4天，由此獲得懸浮的EB。
[0087]將獲得的EB轉移至細胞培養(yǎng)皿并在其中粘附培養(yǎng)，且通過免疫熒光染色觀察到形成的外胚層、內胚層和中胚層分化的細胞。免疫熒光染色的結果指示所有構建的誘導的多能干細胞具有正常的分化能力且可分化成全部三種胚層(圖3a)。
[0088]4-2:畸胎瘤產生
[0089]為檢查誘導的多能干細胞在體內分化的能力，使用采用免疫缺陷小鼠的畸胎瘤產生方法。換言之，為檢查畸胎瘤是否通過誘導的多能干細胞的移植產生，使用將誘導的多能干細胞皮下移植入免疫缺陷SCID小鼠(BALB/c nu)的方法。具體地，將培養(yǎng)的誘導的多能干細胞用PBS洗滌并用胰蛋白酶-EDTA處理以分離單細胞，然后將I，000，000細胞用0.1ml培養(yǎng)基稀釋且將混合物與0.1ml的BD Matrigel基質均勻混合并皮下注射入5-10周齡SCID小鼠側面。注射后，當小鼠保存約8-10周時觀察畸胎瘤是否在小鼠中形成。提取產生的畸胎瘤并使用H&E染色進行組織學分析，且用顯微鏡觀察到分化成為三胚層