。畸胎瘤組織學(xué)分析的結(jié)果指示全部誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系正常產(chǎn)生畸胎瘤且在畸胎瘤中發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的結(jié)構(gòu)(圖3b)。
[0090]實(shí)施例5:檢查包含小分子化合物的組合物對(duì)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞穩(wěn)定維持的作用[0091 ]為檢查包含小分子化合物的組合物對(duì)實(shí)施例2中構(gòu)建和培養(yǎng)的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的作用，實(shí)施了形態(tài)分析、增殖速率分析和基因表達(dá)水平分析。為檢查包含小分子化合物的組合物對(duì)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中的形態(tài)和視覺改變的作用，未用組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(miPSC(-))和使用組合物構(gòu)建的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(miPSC( + ))在具有飼養(yǎng)細(xì)胞的條件和無飼養(yǎng)細(xì)胞條件下相互比較。
[0092]在具有飼養(yǎng)細(xì)胞的條件中，即使當(dāng)不使用包含小分子化合物的組合物時(shí)，在維持細(xì)胞形態(tài)和特性上沒有大問題，但在無飼養(yǎng)細(xì)胞條件中，當(dāng)不使用包含小分子化合物的組合物時(shí)發(fā)生了不需要的分化，使得難以制成顯示均勻形態(tài)的細(xì)胞。然而，當(dāng)使用包含小分子化合物的組合物時(shí)，組合物抑制了不需要的分化，使得以更穩(wěn)定和有效的方式維持誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞成為可能(圖4a)。
[0093]為檢查包含小分子化合物的組合物對(duì)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的增殖速率的作用，將使用組合物產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的增殖速率與(不)使用組合物產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的增殖速率相互比較。將相同數(shù)目的不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)相同時(shí)間，且對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并比較。結(jié)果，顯示細(xì)胞分裂一次所需時(shí)間在用包含小分子化合物的組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中更短，且該更短的時(shí)間幾乎與胚胎干細(xì)胞的情況相似(圖4b)。
[0094]最后，為檢查包含小分子化合物的組合物在維持誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的過程中對(duì)多能基因表達(dá)水平的作用，對(duì)實(shí)施例2中檢查的多能基因的表達(dá)進(jìn)行了量化分析。結(jié)果，顯示使用包含小分子化合物的組合物產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中大多數(shù)多能性基因表達(dá)水平顯著更高(圖4c)。
[0095]實(shí)施例6:檢查包含小分子化合物的組合物對(duì)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的分化能力增加的作用
[0096]為檢查包含小分子化合物的組合物對(duì)在實(shí)施例2中構(gòu)建和培養(yǎng)的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞在分化過程中誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分化能力的作用，在未用組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞和使用組合物產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞間比較了分化成三胚層的效率、產(chǎn)生的畸胎瘤的體積和EB的形成效率。
[0097]通過免疫熒光染色觀察分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的細(xì)胞，且計(jì)數(shù)表達(dá)每種標(biāo)記物的細(xì)胞的數(shù)目，由此測(cè)量分化成三胚層的效率。結(jié)果，顯示使用包含小分子化合物的組合物構(gòu)建的細(xì)胞系與未用組合物處理的細(xì)胞系相比顯示更高的外胚層分化效率。這表明包含小分子化合物的組合物增加誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的分化能力(圖5a和5b)。
[0098]比較了體內(nèi)產(chǎn)生的畸胎瘤的體積。結(jié)果，顯示從未用包含小分子化合物的組合物處理的細(xì)胞系產(chǎn)生的畸胎瘤體積非常小，而從使用包含小分子化合物的組合物構(gòu)建的細(xì)胞系產(chǎn)生的畸胎瘤體積與從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的畸胎瘤體積相似，且本發(fā)明的組合物還增加誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞在體內(nèi)分化的能力(圖5c)。
[0099]測(cè)量從未用包含小分子化合物的組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞形成的EB數(shù)目和從使用包含小分子化合物的組合物產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞形成的EB數(shù)目并相互比較。結(jié)果，顯示包含小分子化合物的組合物還增加EB的形成效率(圖5d)。
[0100]實(shí)施例7:檢查包含小分子化合物的組合物對(duì)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中染色體突變的抑制作用
[0101]為檢查包含小分子化合物的組合物在誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)過程中、誘導(dǎo)過程后細(xì)胞的初始培養(yǎng)過程中、長(zhǎng)期維持和細(xì)胞培養(yǎng)過程中是否增加遺傳穩(wěn)定性，通過分析未用組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞和使用組合物產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的核型而檢查是否發(fā)生染色體突變和染色體突變的頻率。將全部細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)從而突變會(huì)自然發(fā)生，且通過一般的核型分析方法分析其染色體。
[0102]為檢查包含小分子化合物的組合物的作用，將未用組合物處理的細(xì)胞系與用組合物處理的細(xì)胞系進(jìn)行比較。結(jié)果，顯示染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目突變發(fā)生在未用包含小分子化合物的組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中，而染色體突變未發(fā)生在用包含小分子化合物的組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中。此外，可見在使用組合物誘導(dǎo)重編程的初始培養(yǎng)步驟后的長(zhǎng)期培養(yǎng)中，在未用組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(miPSC( ± ))中沒發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)突變，但發(fā)生了染色體數(shù)目突變。這表明包含小分子化合物的組合物可抑制誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中的染色體突變且還具有抑制發(fā)生于重編程誘導(dǎo)步驟、初始培養(yǎng)階段和維持和長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞的后續(xù)階段中的突變的有效能力(圖6a_6d)。
[0103]實(shí)施例8:檢查包含小分子化合物的組合物對(duì)DNA損傷抑制的作用
[0104]在檢查包含小分子化合物的組合物在誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)、誘導(dǎo)步驟后的初始細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞的長(zhǎng)期維持和培養(yǎng)過程中是否增加遺傳穩(wěn)定性的另一分析方法中，分析了DNA損傷的程度。
[0105]使用成纖維細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞在重編程前作為陽性對(duì)照，檢查未用組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的初始(-，pl)代細(xì)胞和長(zhǎng)期傳代(-，p30)細(xì)胞與使用組合物產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的初始( +，pl)代細(xì)胞和長(zhǎng)期傳代( +，p30)細(xì)胞之間DNA損傷程度的差異。基于由DNA損傷產(chǎn)生的γ Η2ΑΧ蛋白的存在或不存在分析DNA損傷的程度，并使用綠色熒光標(biāo)記的抗體通過免疫熒光染色對(duì)感興趣的蛋白染色并分析(圖7a)。
[0106]為更詳細(xì)地分析包含小分子化合物的組合物的作用，分析了γΗ2ΑΧ蛋白在未用組合物處理的細(xì)胞系和用組合物處理的細(xì)胞系之間的生成比率。
[0107]結(jié)果，顯示在未用組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中，約13%的初始代(pi)細(xì)胞和約5%的長(zhǎng)期傳代(ρ30)細(xì)胞經(jīng)歷DNA損傷，而在用組合物處理的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中，僅約5%的初始代(pi)細(xì)胞和僅少于約1%的長(zhǎng)期傳代(ρ30)細(xì)胞經(jīng)歷DNA損傷。這指示在重編程過程中或重編程后的長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中使用小分子化合物顯示與正常成纖維細(xì)胞或重編程前的正常胚胎干細(xì)胞相似的DNA狀態(tài)，表明本發(fā)明的組合物能在誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中抑制DNA損傷至與正常干細(xì)胞中相似的水平(圖7b)。
[0108]工業(yè)實(shí)用性
[0109]如上文所述，根據(jù)本發(fā)明的用于維持誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性的包含小分子化合物的組合物在產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的過程中增加重編程速率和效率，并展示對(duì)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目突變或DNA損傷的優(yōu)異的抑制作用。因此，本發(fā)明的組合物對(duì)于具有優(yōu)異的染色體穩(wěn)定性的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞治療劑的開發(fā)是非常有用的。
[0110]盡管本發(fā)明已參照具體特征進(jìn)行了詳細(xì)說明，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是此說明僅用于優(yōu)選的實(shí)施方案而并非限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將通過所附權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于維持誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性的組合物，其包含至少一種選自下組的小分子化合物作為活性成分:ROCK抑制劑、MEK抑制劑、ALK5抑制劑和抗氧化劑。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述R0CK(RhO相關(guān)激酶)抑制劑為選自下組的至少一種:thiazovivin、Y-27632、法舒地爾(fasudil) (HA-1077)、羥基法舒地爾(HA-1100)、H-1152、3-(4-吡啶基)-1Η-吲哚、N-(4-吡啶基)-N’-(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖和LY29400。3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述MEK(絲裂原活化蛋白激酶)抑制劑是PD0325901或U0126( I，4_二氛基_2，3_二氛基-1,4-二[2-氛基苯基硫基]丁二稀)。4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述ALK5(活化素受體樣激酶5)抑制劑是A-8 3 -O I或SB431542。5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗氧化劑為選自下組的至少一種:L-抗壞血酸、維生素E、維生素A、維生素C、氧代噻唑烷、N-乙酰半胱氨酸、TEMPO、SOD(超氧化物歧化酶)、谷胱甘肽過氧化物酶、清除劑氧、過氧化氫、硫辛酸氧化物自由基、羥基自由基、金屬結(jié)合蛋白、砸、還原的谷胱甘肽、β-胡蘿卜素、黃酮類、芝麻酚、沒食子酸衍生物、Ajowan(印度藏茴香)、谷維素、白藜蘆醇、兒茶素、卵磷脂、腦磷脂、Sulfhydrls(巰基)(SRH)、檸檬酸、抗壞血酸、過氧化氫酶、BHA、BHT、PG、NDGA、對(duì)苯二酚、鄰苯二酚和DPI3D (N，N-二苯基-對(duì)苯二胺)。6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述干細(xì)胞是通過導(dǎo)入選自下組的一種或多種基因誘導(dǎo)的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞:0ct4、Klf4、Sox2和cMyc。7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述染色體穩(wěn)定性通過抑制染色體結(jié)構(gòu)突變和數(shù)目突變或DNA損傷維持。8.—種用于維持誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的組合物處理誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的方法，其中將所述組合物添加至誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的階段中。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述組合物在重編程的誘導(dǎo)后添加。11.一種用于培養(yǎng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的組合物中培養(yǎng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。12.權(quán)利要求11的方法，其進(jìn)一步包括在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于維持多能干細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的組合物，其包含小分子化合物，且更具體地，涉及用于維持誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性的組合物，其包含能夠在誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)和所述細(xì)胞后續(xù)培養(yǎng)過程中抑制染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目突變或DNA損傷的ROCK抑制劑、MEK抑制劑、ALK5抑制劑或抗氧化劑。所述用于維持誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性的包含小分子化合物的組合物在誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞產(chǎn)生過程中增加重編程速率和效率并展示對(duì)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目突變或DNA損傷出色的抑制效果。因此，本發(fā)明的組合物對(duì)具有出色染色體穩(wěn)定性的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞治療劑的開發(fā)非常有用。
【IPC分類】C12N5/074, C12N5/02
【公開號(hào)】CN105579579
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480052269
【發(fā)明人】洪性會(huì), 樸恒洙, 黃仁植, 崔京雅
【申請(qǐng)人】高麗大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2014年7月22日
【公告號(hào)】EP3029138A1, US20160160183, WO2015016523A1