述的載體或由其包裝而成的病毒；W及藥學上可接受的載體或賦型劑；并且，所述的載體 中目的基因為抑癌基因。
[0027] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0028] 圖 KpGLS-Promoter 質粒的圖譜，W及在 Hindlll 和 Miel 中插入 p665/p424/p253 替換SV40啟動子的示意圖。
[0029] 圖2、在pGLS-promoter啟動子位置分別插入來自erbbS基因的p665, p424, p253 基因片段后，報告基因在不同肥R2/neu表達水平腫瘤細胞中英光素酶的相對活性。
[0030] 圖3、pGL3-promoter啟動子區(qū)分別插入p253和突變的p253(SEQ ID N0:2中第 156位發(fā)生G - C點突變，形成SEQ ID N0:1序列）片段后，報告基因質粒在常氧和低氧環(huán) 境下，轉染肥R2/neu陽性腫瘤細胞中英光素酶的相對活性。
[0031] 圖4、A化Η/肥R2-Axin W及陽性對照A化CMV-Axin的重組腺病毒表達載體在常氧 和低氧條件下轉染肥R2/neu不同水平表達的肥R2/neu陽性腫瘤細胞中Axin的表達。
[0032] 圖5、A化H/肥R2-Axin和A化H/肥R2-PTEN的重組腺病毒表達載體在常氧和低氧 環(huán)境下對肥R2/neu陽性（肥C419, MCF7,肥C1954)和陰性腫瘤細胞（肥C806, SMMC7721, SMMC7703)的調(diào)亡誘導作用；其中，
[0033] A ;腺病毒表達載體轉染肥C1419細胞；
[0034] B ;腺病毒表達載體轉染MC巧細胞；
[0035] C ;腺病毒表達載體轉染肥C1954細胞；
[0036] D ;腺病毒表達載體轉染肥C1806細胞；
[0037] E ;腺病毒表達載體轉染SMMC7721細胞；
[0038] F ;腺病毒表達載體轉染SMMC7703細胞。
【具體實施方式】
[0039] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次掲示一種經(jīng)過點突變的肥R2/neu組織特 異性啟動子，命名為pH/肥R2。該啟動子選擇性地在肥R2/neu陽性細胞中具有啟動子活性； 并且其在低氧條件下具有強的啟動子活性，因此適用于在肥R2/neu陽性腫瘤低氧微環(huán)境 下誘導目的基因的高效表達。
[0040] 術語
[0041] 如本文所用，所述的"可操作地連接"是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能 性的空間排列。例如；啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列 的轉錄受到該啟動子區(qū)域的引導，從而，啟動子區(qū)域被"可操作地連接"到該核酸序列上。
[0042] 如本文所用，所述的"啟動子"或"啟動子區(qū)（域）"是指一種核酸序列，其通常存 在于目的基因編碼序列的上游巧'端），能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或 啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。
[0043] 如本文所用，術語"特異性表達"是指目的基因在特定的時間和/或特定的組織表 達。"組織特異（性）啟動子"是指一類啟動子，在其調(diào)控（驅動）下，基因往往只在某些特 定的細胞、器官或組織部位表達。本發(fā)明中，所述的"組織特異性啟動子"是肥R2/neu組織 特異啟動子。
[0044] 如本文所用，"外源的"或"異源的"是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質 序列之間的關系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子 對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是"外源的"。
[0045] 如本文所用，"目的基因"是指可由本發(fā)明的啟動子指導表達的基因。合適的目的 基因包括但不限于；能夠被轉錄成編碼多膚的RNA分子、或被轉錄成反義RNA分子或被轉錄 成針對內(nèi)源基因的干擾RNA或miRNA的目的基因；例如抑癌基因。
[0046] 組織特異性啟動子及其指導的基因表達
[0047] 本發(fā)明提供一種肥R2/neu組織特異啟動子，其具有SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序 列。
[0048] 多核巧酸的雜交是本領域技術人員熟知的技術，特定的一對核酸的雜交特性指示 它們的相似性或同一性。因此，本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO: 1指定的核巧酸序列雜交且兩 個序列之間具有至少70%，較佳地至少80% (例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或 99% )相同性的多核巧酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核巧酸可雜交的 多核巧酸。前提是：所述的多核巧酸中，對應于SEQ ID NO:l的第156位位置的核巧酸為C。
[0049] "嚴格條件"是指；（1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2 XSSC， 0. 1% SDS，6(TC ;或似雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲醜胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或（3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選60% W上、65% W上、 70% W上、75% W上、80 % W上、85% W上或90% W上，更優(yōu)選是95 % W上時才發(fā)生雜交。 并且，可雜交的多核巧酸也具有指導目的基因在肥R2/neu陽性細胞中特異性表達的功能。
[0050] 本發(fā)明還包括與SEQ ID N0:1序列具有70%或W上（優(yōu)選80%W上，更優(yōu)選90% W上，最優(yōu)選95% W上）相同性的核酸，所述核酸也具有指導目的基因在肥R2/neu陽性細 胞中特異性表達的功能。"相同性"是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相 似水平（即序列同源性、相似性或同一性）。
[0051] 本發(fā)明的啟動子可W被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對于啟動子而 言可W是同源的或外源（異源）的。對所述目的基因的核酸序列沒有特別的限制（如一種 功能性、治療性多膚的核酸序列）。
[0052] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述的啟動子對于缺氧狀態(tài)下的體內(nèi)治療是特別有用的。利用所 述肥R2/neu組織特異啟動子控制可轉錄目的基因在肥R2/neu陽性腫瘤細胞中表達，通過 目的基因的性質，如編碼腫瘤抑制蛋白或者可W沉默或者抑制癌基因的反義核酸或干擾 RNA、或者miRNA用于預防和/治療肥R2/neu陽性腫瘤的用途。目的基因也可W是編碼用 于反映體內(nèi)存在肥R2/neu陽性腫瘤細胞的指示分子，用于判斷肥R2/neu陽性腫瘤治療后 的復發(fā)和預后等監(jiān)測用途。
[0053] 本發(fā)明的啟動子除了在常氧條件下具有良好的肥R2/neu組織特異啟動子活性， 可用于調(diào)控在肥R2陽性細胞中目的基因表達的用途；其更大的優(yōu)勢在于；在低氧條件下， 其具有顯著更強的啟動子活性，適合于在低氧微環(huán)境下在肥R2陽性細胞中控制可轉錄目 的基因高表達的用途，因此，本發(fā)明的pH/肥R2啟動子可被應用于抗肥R2陽性腫瘤基因治 療領域。
[0054] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述的目的基因編碼人類抑癌蛋白Axin分子；在本發(fā) 明的另一個實施例中，所述的目的基因編碼人類抑癌蛋白PTEN分子。應理解，在閱讀了本 發(fā)明后，任何需要進行肥R2/neu陽性細胞針對性驅動表達的應用均包含在本發(fā)明中。
[00巧]任何一種前述的啟動子和/或目的基因序列可被包含在重組載體中。
[0056] 作為一種方式，所述的重組載體包括本發(fā)明的啟動子，在所述啟動子的下游包含 多克隆位點或至少一個酶切位點。當需要表達目的基因時，將目的基因連接入適合的多克 隆位點或酶切位點內(nèi)，從而將目的基因與啟動子可操作地連接。
[0057] 作為另一種方式，所述的重組載體包括（從5'到3'方向）：引導目的基因轉錄的 啟動子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可W包括3'轉錄終止子，3'多聚核巧酸 化信號，其它非翻譯核酸序列，轉運和祀向核酸序列、抗性選擇標記、增強子或操作子。
[0058] 用于制備重組載體的方法是本領域熟知的。術語"重組表達載體"指本領域熟知 的細菌質粒、瞻菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要 其能夠在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都是可W被采用的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方 式，所述的載體是病毒。
[0059] 本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含有本發(fā)明所述的啟動子和/或目的 基因序列的表達載體。送些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等。 表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
[0060] 此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，W提供用于選擇轉化的 宿主細胞的表型性狀，如氨予青霉素抗性、新霉素抗性、潮霉素抗性等。
[0061] 重組載體中除了含有本發(fā)明的啟動子，還可含有一種或多種其它啟動子。所述的 其它啟動子例如是：組織特異性的、組成型的或誘導型的。
[0062] 包含上述適當?shù)膯幼雍湍康幕虻妮d體，可W用于轉化或轉染適當?shù)乃拗骷?胞，W使其能夠表達目的基因。根據(jù)所應用的領域，本領域一般技術人員都清楚如何選擇適 當?shù)妮d體和宿主細胞。
[0063] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，送些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限