制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第Η版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0064] 實施例1、潛在的肥R2/neu組織特異啟動子基因
[0065] 經(jīng)過大量分析研究，發(fā)明人初步確定人肥R2/neu (Homo sapiens v-e;rb-b2avian e^tboblastic le址emia viral oncogene homolog 2 煙犯B2))基因組織特異啟動子的大 致范圍（+16000-+17000)(參考序列ID:ref|NG_007503. 1|);在該序列中找到潛在核必啟 動子的CAAT和TATAA盒，發(fā)現(xiàn)在+16798存在潛在的CAAT盒，在16896存在潛在的TATAA盒， 因此W此為中必，向3'下游擴展200bp左右，5'上游擴展5(K)bp，將該區(qū)輸入JASPAR數(shù)據(jù) 庫；根據(jù)已有的控制肥R2/neu表達的轉(zhuǎn)錄因子和通用核因子（如；SP1，GATA2，NFKB，ARNT， ET巧結(jié)合序列信息，確定Η個基因區(qū)，分別為；253bp(+16713--+16965)，命名為p253 ; 424bp (+16678--+17101)，名 p424 ;和 66化P (+16437--+17101)，命名 p665。分別為：
[0066] l)253bp (+16713 ~+16965)，命名為 p253-HER2/neu (簡稱 p253)，核巧酸序列如 沈Q ID NO:2所示；
[0067] 2) 424bp (+16678 ~+17101)，命名為 p424-HER2/neu (簡稱 p424)，核巧酸序列如 沈Q ID NO:3所示；
[0068] 3) 66化P (+16437 ~+17101)，命名為 p665-HER2/neu (簡稱 p665)，核巧酸序列如 沈Q ID NO:4所示。
[0069] 實施例2、構(gòu)建含有p665/p424/p253啟動子英光素酶報告基因質(zhì)粒
[0070] 根據(jù)上述SEQ ID N0:2,3,4基因區(qū)序列，設(shè)計首尾序列、兩端添加限制性酶切位點 (化el和化ndlll)和保護堿基、合成引物。分別為：
[0071] p253上下游引物對：
[0072] 沈Q ID N0:5 ;5' -CTAGCTAGCAACCCAGGCGTCCCGGCGC-3' ；
[0073] 沈Q ID N0:6 ;5' -CCCAAGCTTCCCGGGGGGCTCCCCTGGTTTC-3^ ；
[0074] p424上下游引物對：
[00巧]沈Q ID N0:7 ;5, -CTAGCTAGCATTCTCCGAGGAAAAGTGTGAGAAC~3^ ；
[0076]沈Q ID N0:8 ;5' -CCCAAGCTTATGGTGCTCACTGCGGCTCC-3^ ；
[0077] p665上下游引物對：
[0078] 沈Q ID N0:9 ;5, -CTAGCTAGCGGAAGCCACAAGGTAAACACAACACATC CCCC-3,；
[0079] 沈Q ID N0:10 ;5' -CCCAAGCTT ATGGTGCTCACTGCGGCTCC-3'。
[0080] W人MC巧腫瘤細胞基因組DNA為模板，PCR方法擴增上述Η個潛在的啟動子基因 片段。PCR擴增條件：
[0081]
[0082] 將上述PCR擴增片段，經(jīng)膠回收、雙限制性酶切，克隆入p-GL3-promoter (獲自 Promega)英光素酶報告基因質(zhì)粒中；挑選測序正確的陽性克隆、大量擴增純化。如圖1，在 Miel 和 Hindlll 中插入 p665/p424/p253 替換 SV40 啟動子。
[0083] 實施例3、篩選肥R2/neu組織特異啟動子
[0084] 將分別攜帶P253, p424, p665報告基因質(zhì)粒、用脂質(zhì)體化ipofectin2000,購自 invitrogen)轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染入表達不同水平肥R2/neu抗原的腫瘤細胞（肥C-1954;肥R2/ neiTd ;肥C-1419 ;肥R2/neuhi，肥C1806 ;肥R2/neu，Lovo ;肥R2/neu，購自美國 ATCC)。細 胞接種于96孔板，細胞濃度為1-5X 10^孔，標準條件下培養(yǎng)1化后，參照說明書使用 lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，每孔共轉(zhuǎn)40ng英光素酶報告基因質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒，Wng P化-TK-英 光素酶內(nèi)參質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24h后，使用雙英光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測英光活性。記錄 Firefly英光值與內(nèi)參Renilla英光值的比值，即為報告基因活性值。
[0085] 結(jié)果如圖2,顯示p253具有較強的啟動子活性、并且英光素酶活性與肥R2/neu的 表達水平具有正相關(guān)關(guān)系，而p424, p665的啟動子活性較弱。因此，p253具有肥R2/neu組 織特異啟動子活性。
[0086] 實施例4、低氧誘導增強的肥R2/neu組織特異啟動子
[0087] 針對P253中的序列g(shù)gaggtgg，本發(fā)明人將該序列的第四個堿基突變?yōu)镃，即對該 位置進行G/C的點突變，突變后的p253如序列表中SEQ ID NO: 1所述。設(shè)計引入突變的引 物對為：
[0088] 沈Q ID N0:11 ;5, -CAATCACAGGAGAAGGAGGACGTGGAGGAGGAGG GCTGC-3,；
[0089] 沈Q ID N0:12 ;5' -GCAGCCCTCCTCCTCCACGTCCTCCTTCTCCTGTGATTG-3'。
[0090] W P253的報告基因質(zhì)粒為模板，擴增全長質(zhì)粒序列，經(jīng)化nl酶清除模板質(zhì)粒 (未發(fā)生突變的）、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化D冊α ;挑取數(shù)個克隆，小提質(zhì)粒，測序驗證。成功突變后的 p253-HER2/neu組織特異啟動子報告基因質(zhì)粒于D冊α中大量擴增純化。
[0091] 分別在常氧（21 % 〇2)和低氧（2% 〇2)環(huán)境下，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染p253-HER2/neu組織特 異啟動子報告基因質(zhì)粒和突變后的p253-HER2/neu組織特異啟動子報告基因質(zhì)粒于肥R2/ neu陽性和陰性腫瘤細胞。細胞接種于96孔板，細胞濃度為1-5 X 10^孔，標準條件下培養(yǎng) 1化后，參照說明書使用lip〇2000轉(zhuǎn)染試劑，每孔共轉(zhuǎn)40ng英光素酶報告基因質(zhì)粒或?qū)φ?質(zhì)粒，Wng p化-ΤΚ-英光素酶內(nèi)參質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24h后，使用雙英光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢 測英光活性。記錄Firefly英光值與內(nèi)參Renilla英光值的比值，即為報告基因活性值。
[0092] 如圖3所示，在低氧環(huán)境下，在肥R2/neu陽性腫瘤細胞中突變后的p253-HER2/neu 組織特異啟動子誘導英光素酶的活性顯著高于未突變的p253-HER2/neu組織特異啟動子， 但二者在肥R2/neu陰性腫瘤細胞中的啟動子活性均較低；在常氧環(huán)境下，未突變和突變的 p253-HER2/neu組織特異啟動子在肥R2/neu陽性腫瘤細胞中的啟動子活性沒有明顯差異， 說明突變后的p253-HER2/neu組織特異啟動子依然保持有肥R2/neu組織特異啟動子活性， 但在低氧環(huán)境下比未突變的有更強的啟動子活性，因此命名為低氧增強的肥R2組織啟動 子（pH/肥R2)，如圖3。
[0093] 實施例5、攜帶突變后p253啟動子元件（pH/肥R2)和抑癌基因（Axin或PTEN)的 肥R2/neu組織特異啟動子重組腺病毒載體的構(gòu)建及表達
[0094] 1、pHBAd-U6-CMV-Axin 或 PTEN 表達載體的構(gòu)建
[009引根據(jù)人Axin和PTEN的cds序列，設(shè)計引物，W人單核來源樹突狀細胞cDNA為 模板，分別擴增Axin和PTEN ;擴增片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和化nl酶切后，插入到 pHBAd-U6-CMV載體（購自漢恒生物科技（上海）有限公司）的多克隆位點中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化D冊α，篩選測序正確的克隆，獲得pHBAd-U6-CMV-Axin/PTEN表達載體。
[0096] Axin 引物對：
[0097] 沈Q ID N0:13 ;5' -AAACGGAATTCATGAATATCCAAGAGCAGGGTTTCC-3'；
[0098] 沈Q ID N0:14 ;5, -AACGGGGTACCGTCCACCTTCTCCACTTTGCCGATGA-3^ ；
[0099] PTEN 引物對：
[0100] 沈Q ID N0:15 ;5, -AAACGGAATTCATGACAGCCATCATCAAAGAGATC-3' ；
[0101] SEQ ID N0:16 :5' -AACGGGGTACCGACTTTTGTAATTTGTGTATGCTG~3^。
[0102] 2、pHBAd-H/肥R2-Axin/PTEN 表達載體的構(gòu)建
[0103] 根據(jù)pHBAd-U6-CMV-Axin/PTEN表達載體中啟動子區(qū)上下游酶切位點特征，W前 述制備的包含有突變后的p253-HER2/neu的英光素酶報告基因質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物擴增 pH/