中，12 000巧m離屯、Imin，棄濾液。
[00化](6)向Spin Colu皿中加入500μ1 的Rinse A，室溫放置Imin，12 000巧m離屯、Imin， 棄濾液。
[0087] (7)向Spin Column中加入800μ1 的Rinse B，12 000巧m離屯、Imin。
[0088] (8)棄濾液。再次12 000巧m離屯、Imin。
[0089] (9)將Spin Colu皿移至新的1.5ml微量離屯、管上，將20μ1無(wú) RNase水加入到Spin Column膜的中央處，室溫放置Imin。
[0090] (10) 12 000巧m離屯、Imin洗脫RNA。測(cè)定0D值確定RNA濃度并于_7(TC保存。
[0091] 將提取的疫苗RNA按照PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)試 劑盒說(shuō)明書(shū)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在雙重巧光定量PCR反應(yīng)W水作為陰性對(duì)照，重組質(zhì)粒作為陰 性對(duì)照，待檢樣品為逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。
[0092] 4.陽(yáng)性對(duì)照品的制備
[0093] 4.1目的片段的克隆
[0094] 4.1.1逆轉(zhuǎn)錄體系
[0095]
[0096] 反應(yīng)條件:室溫靜置10min，42°C保溫化后冰浴2min。
[0097] 4.1.2 PCR擴(kuò)增體系及條件
[009引
[0099] 反應(yīng)條件：
[0100] 預(yù)變性94°C 5min 變性94°C 80s 退火52°C 80s 延伸72°C 80s 72°C 10min32個(gè) 循環(huán)。
[0101] 4.1.3 PCR產(chǎn)物的回收
[0102] PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片 段，具體過(guò)程見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0103] 4.1.4重組質(zhì)粒 PMD18-T/HTN 和 PMD18-T/SE0 的構(gòu)建
[0104] (1)取 1〇μ1 Solution I和化 1 PMD18-T載體混勻，瞬離。
[0105] (2)將上述混合物分裝成兩管，每管化1。標(biāo)號(hào)1和2。
[0106] (3)在1號(hào)和2號(hào)管中分別加入I型和Π 型膠回收產(chǎn)物各化1。
[0107] (4)16°C水浴連接過(guò)夜。
[010引 4.1.5 D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0109] (1)將大腸桿菌D冊(cè)α保存菌液涂布于無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0110] (2)挑取單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，160巧m搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
[0111] (3)取0.5ml菌液對(duì)接到100ml LB液體培養(yǎng)基中。37°C，leOrpm搖床振蕩培養(yǎng)約化， 至菌液0D值為0.5左右。
[0112] (4)將菌液分裝到50ml滅菌離屯、管中，冰浴10miru4°C，2 500rpm離屯、lOmin，棄去 上清。
[0113] (5)加入預(yù)冷的化C12溶液10ml。冰上小屯、懸浮細(xì)胞。4°C，2 00化pm離屯、7min。
[0114] (6)重復(fù)步驟(5)-次。此步加完化C12溶液后需先冰浴30min再離屯、，棄取上清。
[0115] (7)加入預(yù)冷的化C12溶液2ml。小屯、懸浮細(xì)胞。分裝，一 70°C保存。
[0116] 4.1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
[0117] 從一70°C冰箱中取出D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞冰浴融化。加入扣1重組質(zhì)粒。冰浴30π?ηη42 。(:熱擊1.5min。加入40化1 LB液體培養(yǎng)基，37°C，100巧m振蕩培養(yǎng)約化。然后涂布于含有氨 節(jié)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37Γ倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
[011引 4.1.7重組質(zhì)粒的大量制備
[0119] 從過(guò)夜培養(yǎng)的平皿上挑取單個(gè)菌落并接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中。37°C，180巧m 振蕩培養(yǎng)約化。待重組菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，利用化KaRa Mini邸ST Plasmid化rification Kit按照操作說(shuō)明提取質(zhì)粒，并于一20°C保存。
[0120] 4.2目的片段的鑒定 [01別]4.2.1 PCR法鑒定
[0122] 分別W重組質(zhì)粒PMD18-T/HTN和PMD18-T/SE0為模板，擴(kuò)增體系如下：
[0123]
[0124] 反應(yīng)條件同前。
[01巧]4.2.2酶切消化法鑒定
[01%] 選擇EcoR I、Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行消化。其中，EcoR I酶切位點(diǎn)位于載體 456bp處，I型和Π 型重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切后產(chǎn)生的片段分別為2 785bp和2 8"bpeHind III酶切位點(diǎn)位于載體399bp處，I型和Π 型重組質(zhì)粒經(jīng)化nd III和EcoR I雙酶切后各產(chǎn)生 兩條片段，I型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度分別為15化P和2 63化ρ，Π 型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn) 生的片段長(zhǎng)度分別為20化Ρ和2 63化Ρ。酶切反應(yīng)體系如下：
[0127] (1化coR I單酶切反應(yīng)體系，反應(yīng)體系(2化1)如下：
[012 引
[01巧]混勻上述液體，37Γ水浴化。
[0130] (2化ind III和EcoR I雙酶切反應(yīng)體系，反應(yīng)體系（2化1)如下：
[0131]
[0132] 混勻上述液體，37°C水浴化。
[0133] 4.2.3測(cè)序鑒定
[0134] 將提取的質(zhì)粒送至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。并使用BLAST將測(cè)序 結(jié)果與PS-6株和L99株的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。
[0135] 5.雙重巧光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確立
[0136] 反應(yīng)總體積為20μ1，具體如下：
[0137]
[013 引
[0139] 反應(yīng)條件如下：
[0140] 預(yù)變性94°C 2min 變性94°C 15s 退火60°Clmin 40個(gè)循環(huán)
[0141] 6.雙重巧光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
[0142] 6.1引物和探針組合的選擇
[0143] 本實(shí)驗(yàn)對(duì)I型和Π 型分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物及1條巧光探針，按照表中的組合來(lái)進(jìn)行 巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)篩選出最佳 引物和探針組合。
[0144] 巧光定量PCR引物和探針組合設(shè)計(jì)
[0145]
[0146] 6.2引物濃度的優(yōu)化
[0147] 巧光定量PCR反應(yīng)的引物濃度一般在Ο.ΙμΜ~ΙμΜ之間優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)的引物濃度分 別設(shè)計(jì)為0.2μΜ，0.4μΜ，0.6μΜ和0.祉Μ，按表設(shè)立的組合進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反 應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)確定最佳引物濃度。
[0148] 巧光定量PCR引物濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表
[0149]
[0150] 6.3探針濃度的優(yōu)化
[0151] 巧光定量PCR反應(yīng)的探針最佳濃度一般在0.化Μ~0.扣Μ之間優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)的探針 濃度分別設(shè)計(jì)為0.2μΜ，0.3μΜ，0.4μΜ，按表設(shè)立的組合進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反 應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)確定最佳探針濃度。
[0152] 巧光定量PCR探針濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表
[0153]
[0154] 6.4Mg化濃度的優(yōu)化
[0155] Mg2+濃度大小對(duì)酶的催化活性影響很大，因此需要對(duì)Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn) 將Mg2+終濃度分別設(shè)定為W下6個(gè)濃度，見(jiàn)表。進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反應(yīng)的Ct 值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)確定最佳^te化濃度。
[0156] 巧光定量PCR反應(yīng)Mgh濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)表
[0157]
[0158] 6.5 dNTPs濃度的優(yōu)化
[0159] dNTPs作為PCR反應(yīng)的底物，其濃度的高低對(duì)反應(yīng)效率也會(huì)產(chǎn)生很大的影響，因此 需要對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)選擇6個(gè)濃度梯度進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，見(jiàn)下表。通過(guò)每組 反應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)確定最佳dNTPs濃度。
[0160] 巧光定量PCR反應(yīng)dNTPs濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)表
[01611
[0162] 6.6 Ex Taq服濃度的優(yōu)化
[0163] 在W上優(yōu)化最佳條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行酶濃度的優(yōu)化，W達(dá)到最佳的酶促反應(yīng)效率。 本實(shí)驗(yàn)將Ex化地S終濃度分別設(shè)定為W下5個(gè)濃度，見(jiàn)表。進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組 反應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)確定最佳酶濃度。
[0164] 巧光定量PCR反應(yīng)酶濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)表
[01 化]
[0166] 6.7牛血清白蛋白（BSA)濃度的優(yōu)化
[0167] BSA為化q酶的酶穩(wěn)定劑，加入適量的BSA，可W穩(wěn)定巧光定量PCR反應(yīng)，提高擴(kuò)增效 率，因此有必要對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)將BSA終濃度分別設(shè)定為W下5個(gè)濃度，見(jiàn)表。進(jìn) 行定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)選擇最佳的 BSA濃度。
[0168] 巧光定量PCR反應(yīng)BSA濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)表
[0169]
[0170] 7.檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)
[0171] 7.1特異性評(píng)價(jià)
[0172] 利用建立的檢測(cè)方法分別對(duì)腎綜合征出血熱I型和Π 型單價(jià)疫苗原液、雙價(jià)腎綜 合征出血熱滅活疫苗(地鼠腎細(xì)胞）、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗（沙鼠腎細(xì)胞）、凍干甲 型肝炎減毒活疫苗、森林腦炎滅活疫苗、凍干水痘減毒活疫苗W及麻疹減毒活疫苗進(jìn)行檢 測(cè)，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性。
[0173] 7.2靈敏度評(píng)價(jià)
[0174] 取測(cè)序正確的陽(yáng)性對(duì)照品質(zhì)粒，計(jì)算最初拷貝數(shù)，取一定量分別做10倍梯度稀釋， 進(jìn)行雙重巧光定量PCR反應(yīng)，觀察其最低檢出拷貝數(shù)，確定質(zhì)粒檢測(cè)的靈敏度。
[01巧]重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)計(jì)算方法：
[0176]質(zhì)?？截悢?shù)(copies/單位體積）=(質(zhì)粒濃度/質(zhì)粒分子量）X阿伏加德羅常數(shù)。其 中質(zhì)粒分子量=總的堿基對(duì)數(shù)X660D/bp，其中660代表的是1個(gè)堿基對(duì)的分子量為660道爾 頓;阿伏加德羅常數(shù)為每摩爾物質(zhì)含有的微粒數(shù)，其數(shù)值約為6.02 X 1023。本實(shí)驗(yàn)得到的I型 質(zhì)粒濃度為14化g/μΙ,Π 型質(zhì)粒濃度為156.5ngAU。通過(guò)上述公式計(jì)算可得出，I型質(zhì)粒初 始拷貝數(shù)為4.68X l〇i%piesAU，Π 型質(zhì)粒初始拷貝數(shù)為5X lO^copiesAU。再取各10μ1 倍比稀釋到所需要的濃度。
[0177] 7.3重復(fù)性評(píng)價(jià)
[017引 7.3.1批內(nèi)重復(fù)性
[0179] 取同一批次兩個(gè)濃度的陽(yáng)性對(duì)照品，將I型4.68 X 106copi es/μ 1和Π 型5 X l〇6copies/yl等量混合，I型4.68 X l〇4copies/yl和 Π 型5 X l〇4copies/yl等量混合，每組混 合質(zhì)粒用同一批反應(yīng)試劑分別做八管平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組的CV值。
[0180] 7.3.2批間重復(fù)性
[0181 ] 取同一批次Ξ個(gè)濃度的陽(yáng)性對(duì)照品，將I型4.68 X 1 〇6copi es/μ 1和Π 型5 X l〇6copies/yl等量混合，I型4.68 X l〇5copies/yl和 Π 型5 X l〇5copies/yl等量混合，I型 4.68X 104copies/yl和Π 型5X 104copies/yl等量混合，每組混合質(zhì)粒分別用Ξ個(gè)批次的反 應(yīng)試劑做3管平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組的CV值。