2巧]6.5 dNTPs濃度的優(yōu)化
[0280] dNTPs作為PCR反應(yīng)的底物，其濃度的高低對(duì)反應(yīng)效率也會(huì)產(chǎn)生很大的影響，因此 需要對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)選擇6個(gè)濃度梯度進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，見(jiàn)下表。通過(guò)每組 反應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)確定最佳dNTPs濃度。
[0281] 巧光定量PCR反應(yīng)dNTPs濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)表
[0282]
[0283] 6.6 Ex Taq服濃度的優(yōu)化
[0284] 在W上優(yōu)化最佳條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行酶濃度的優(yōu)化，W達(dá)到最佳的酶促反應(yīng)效率。 本實(shí)驗(yàn)將Ex化地S終濃度分別設(shè)定為W下5個(gè)濃度，見(jiàn)表。進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組 反應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)確定最佳酶濃度。
[0285] 巧光定量PCR反應(yīng)酶濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)表
[0286]
[0287] 6.7牛血清白蛋白（BSA)濃度的優(yōu)化
[0288] BSA為化q酶的酶穩(wěn)定劑，加入適量的BSA，可W穩(wěn)定巧光定量PCR反應(yīng)，提高擴(kuò)增效 率，因此有必要對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)將BSA終濃度分別設(shè)定為W下5個(gè)濃度，見(jiàn)表。進(jìn) 行定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴(kuò)增曲線形狀等結(jié)果來(lái)選擇最佳的 BSA濃度。
[0289] 巧光定量PCR反應(yīng)BSA濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)表
[0290]
[0291] 7.檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)
[0巧2] 7.1特異性評(píng)價(jià)
[0293] 利用建立的檢測(cè)方法分別對(duì)腎綜合征出血熱I型和Π 型單價(jià)疫苗原液、雙價(jià)腎綜 合征出血熱滅活疫苗(地鼠腎細(xì)胞）、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗（沙鼠腎細(xì)胞）、凍干甲 型肝炎減毒活疫苗、森林腦炎滅活疫苗、凍干水痘減毒活疫苗W及麻疹減毒活疫苗進(jìn)行檢 測(cè)，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性。
[0294] 7.2靈敏度評(píng)價(jià)
[02M]取測(cè)序正確的陽(yáng)性對(duì)照品質(zhì)粒，計(jì)算最初拷貝數(shù)，取一定量分別做10倍梯度稀釋?zhuān)?進(jìn)行雙重巧光定量PCR反應(yīng)，觀察其最低檢出拷貝數(shù)，確定質(zhì)粒檢測(cè)的靈敏度。
[0296] 重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)計(jì)算方法：
[0297] 質(zhì)?？截悢?shù)(copies/單位體積）=(質(zhì)粒濃度/質(zhì)粒分子量）X阿伏加德羅常數(shù)。其 中質(zhì)粒分子量=總的堿基對(duì)數(shù)X660D/bp，其中660代表的是1個(gè)堿基對(duì)的分子量為660道爾 頓;阿伏加德羅常數(shù)為每摩爾物質(zhì)含有的微粒數(shù)，其數(shù)值約為6.02 X 1023。本實(shí)驗(yàn)得到的I型 質(zhì)粒濃度為14化g/μΙ,Π 型質(zhì)粒濃度為156.5ngAU。通過(guò)上述公式計(jì)算可得出，I型質(zhì)粒初 始拷貝數(shù)為4.68X l〇i%piesAU，Π 型質(zhì)粒初始拷貝數(shù)為5X lO^copiesAU。再取各10μ1 倍比稀釋到所需要的濃度。
[0巧引 7.3重復(fù)性評(píng)價(jià)
[0299] 7.3.1批內(nèi)重復(fù)性
[0300] 取同一批次兩個(gè)濃度的陽(yáng)性對(duì)照品，將I型4.68 X 106copi es/μ 1和Π 型5 X l〇6copies/yl等量混合，I型4.68 X l〇4copies/yl和 Π 型5 X l〇4copies/yl等量混合，每組混 合質(zhì)粒用同一批反應(yīng)試劑分別做八管平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組的CV值。
[0301] 7.3.2批間重復(fù)性
[0302] 取同一批次Ξ個(gè)濃度的陽(yáng)性對(duì)照品，將I型4.68 X 1 〇6copi es/μ 1和Π 型5 X l〇6copies/yl等量混合，I型4.68 X l〇5copies/yl和 Π 型5 X l〇5copies/yl等量混合，I型 4.68X 104copies/yl和Π 型5X 104copies/yl等量混合，每組混合質(zhì)粒分別用Ξ個(gè)批次的反 應(yīng)試劑做3管平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組的CV值。
[0303] 雙重巧光定量PCR檢測(cè)方法的結(jié)果判定
[0304]根據(jù)Ct值大小及擴(kuò)增曲線的情況判定待檢樣品是否為陽(yáng)性。當(dāng)Ct值。5.0且出現(xiàn) 典型的擴(kuò)增曲線時(shí)，判定為陽(yáng)性;若無(wú) Ct值且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，則判定為陰性；當(dāng)Ct值〉 35.0且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線時(shí)建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值含35.0且有典型擴(kuò)增曲線者 判為陽(yáng)性，否則為陰性。
[0305]本發(fā)明建立的雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的雙重巧光定量RT-PCR方 法，方法簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)且靈敏度高，是公認(rèn)的病原體快速檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。適用于所有的 雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的鑒別。
[0306] 實(shí)施例1結(jié)果：
[0307] 1、雙重巧光定量PCR屬特異性試驗(yàn)結(jié)果匯總表 [030引表1:雙重巧光定量PCR屬特異性試驗(yàn)的Ct值
[0309]
[0310] 2、雙重巧光定量PCR型特異性試驗(yàn)結(jié)果匯總表
[0311] 表2:雙重巧光定量PCR型特異性試驗(yàn)的Ct值
[0312]
[0313] 3、質(zhì)粒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果匯總表
[0314] 表3:質(zhì)粒靈敏度檢測(cè)的Ct值
[0315]
[0316]
[0317] 4、雙重巧光定量PCR批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果匯總表 [031引表4:雙重巧光定量PCR批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)的Ct值
[0319]
[0320] 5、雙重巧光定量PCR批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果匯總表
[0321] 表5:雙重巧光定量PCR批間重復(fù)性檢測(cè)的Ct值
[0322]
[0323] 實(shí)施例2結(jié)果：
[0324] 1、雙重巧光定量PCR屬特異性試驗(yàn)結(jié)果匯總表
[0325] 表1:雙重巧光定量PCR屬特異性試驗(yàn)的Ct值
[032引 2、雙重巧光定量PCR型特異性試驗(yàn)結(jié)果匯總表
[0326]
[0327]
[0329] 表2:雙重巧光定量PCR型特異性試驗(yàn)的Ct值
[0330]
[0331 ] 3、質(zhì)粒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果匯總表
[0332] 表3:質(zhì)粒靈敏度檢測(cè)的Ct值
[0333]
[0334] 4、雙重巧光定量PCR批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果匯總表
[0335] 表4:雙重巧光定量PCR批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)的Ct值
[0336]
[0337]
[0338] 5、雙重巧光定量PCR批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果匯總表
[0339] 表5:雙重巧光定量PCR批間重復(fù)性檢測(cè)的Ct值
[0340]
[0；341 ]結(jié)論
[0342]本發(fā)明建立的雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的雙重巧光定量RT-PCR方 法，能夠彌補(bǔ)現(xiàn)用PRNT法操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，影響因素較多的缺點(diǎn)，并且可W解決單克隆 抗體很難準(zhǔn)確分型運(yùn)一當(dāng)前實(shí)驗(yàn)難題。方法簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)且靈敏度高，該方法還具有 一下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1)特異性好，通過(guò)引物或探針與模板的特異性雜交對(duì)模板進(jìn)行鑒別，使檢 測(cè)的特異性大大提高；（2)靈敏度高，RQ-P邸比常規(guī)鑒別分型方法的靈敏度要高2~3個(gè)數(shù)量 級(jí)，有時(shí)甚至可W檢測(cè)到單拷貝的基因；（3)準(zhǔn)確性好，由于Ct值與祀基因的起始拷貝數(shù)的 對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，因而可W對(duì)樣品祀序列進(jìn)行準(zhǔn)確定量；（4)重復(fù)性好，RQ-PCR針對(duì)同一濃 度祀基因檢測(cè)的Ct值具有很好的重現(xiàn)性。（5)操作簡(jiǎn)單、快速，自動(dòng)化程度高。（6)采用完全 閉管檢測(cè)，不需對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，因而有效的避免了交叉污染。是公認(rèn)的病原體快速檢測(cè)金 標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)研究該方法適用于所有的雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的鑒別。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的方法，其特征在于： I型引物及探針序列： HTNF1：5'-CAGAGGGAAATCAATGCC-3' HTNR1:5 '-CTCATCTGGATCCTTTTCA-3 '； HTNF2：5'-TATGGAGGAACTACAGAGG-3'； HTNR2:5 '-TCTGGATCCTTTTCATATTG-3 '； HTNP：5'-FAM-TCTGCATCTCTCACCT-MGB-3'； Π 型引物及探針序列： SE0F1:5 '-ATAGCACGCCAGAAAGTC-3 '； SE0R1:5 '-ATCCTGTCGGCAAGTTGG-3 '； SE0F2：5'-AAGTCAAGGATGCAGAAAAG-3'； SE0R2:5 '-ATTGTATTGAAGCTGCGACA-3 '； SEOP:5，-HEX-CTTAAACAAGAGGACAC-MGB-3，。2. -種檢測(cè)雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的方法，包括以下步驟： 1) 滅活出血熱病毒的電鏡觀察； 2) 引物和探針的設(shè)計(jì)： 共設(shè)計(jì)了4對(duì)引物和2條熒光探針，I型和Π 型各兩對(duì)引物和一條探針;序列如下如權(quán)利 要求1所示； 3) 滅活出血熱病毒RNA的提?。? 米用TRIzol法和試劑盒法； 4) 陽(yáng)性對(duì)照品的制備： 目的片段的克隆； 建立逆轉(zhuǎn)錄體系； PCR產(chǎn)物的回收； PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段； 組質(zhì)粒 PMD18-T/HTN 和 pMD18-T/SE0 的構(gòu)建； DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備； 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞： 從一70°C冰箱中取出DH5a感受態(tài)細(xì)胞冰浴融化;加入5 μL重組質(zhì)粒;冰浴30 min;42°C 熱擊1.5 min;加入400 μL LB液體培養(yǎng)基，37°C，100 rpm振蕩培養(yǎng)約1 h;然后涂布于含有 氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜； 重組質(zhì)粒的大量制備： 從過(guò)夜培養(yǎng)的平皿上挑取單個(gè)菌落并接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中；37°C，180 rpm振 蕩培養(yǎng)約6 h;待重組菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，利用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit按照操作說(shuō)明提取質(zhì)粒，并于一 20°C保存； 目的片段的鑒定： PCR法鑒定； 酶切消化法鑒定 選擇EcoR I、Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行消化;其中，EcoR I酶切位點(diǎn)位于載體456 bp 處，I型和Π 型重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR頂每切后產(chǎn)生的片段分別為2 785 bp和2 841 bp; Hind ΙΠ 酶切位點(diǎn)位于載體399 bp處，I型和Π 型重組質(zhì)粒經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶 切后各產(chǎn)生兩條片段，I型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度分別為150 bp和2 635 bp，n型重 組質(zhì)粒酶切產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度分別為206 bp和2 635 bp; 測(cè)序鑒定： 將提取的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序;并使用BLAST將測(cè)序結(jié)果與PS-6株和L99株的基因序列進(jìn)行比 對(duì)分析； 5)雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確立。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種檢測(cè)雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的方法，提供了一種新的滅活疫苗進(jìn)行分型鑒別的方法，利用雙重?zé)晒舛縍T-PCR、采用新一代TaqMan？MGB探針技術(shù)，能夠?qū)?guó)內(nèi)現(xiàn)有的雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗（沙鼠腎細(xì)胞）、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗（地鼠腎細(xì)胞）以及雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗（Vero細(xì)胞）進(jìn)行分型鑒別，并且出血熱病毒Ⅰ型和Ⅱ型質(zhì)粒檢測(cè)的靈敏度分別達(dá)到4.68×101？copies/μl和5×101？copies/μl。該方法特異性很好而且能夠準(zhǔn)確分型，可以將其用于雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗的分型鑒別。
【IPC分類(lèi)】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105586436
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510717584
【發(fā)明人】姜崴, 李玉華, 馬寧, 陳博, 孫洪亮, 宋宗明, 惠琦, 付博
【申請(qǐng)人】長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2016年5月18日
【申請(qǐng)日】2015年10月30日