一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于遺傳學(xué)領(lǐng)域中的酵母等位基因整合技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種釀酒酵母 等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry)的進(jìn)步，使得我們能夠利用質(zhì)譜快速、高通量 的鑒定基因的轉(zhuǎn)錄、修飾。而對與基因進(jìn)行功能分析則需要對無修飾和(或)模擬修飾的等 位基因突變體進(jìn)行表型鑒定。對于釀酒酵母，這種等位基因可以通過攜帶相應(yīng)的缺失或條 件性等位基因的著絲粒質(zhì)粒來進(jìn)行分析。然而，為了避免質(zhì)粒攜帶等位基因時因拷貝數(shù)量 和(或)錯誤轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活而引起的潛在問題，有時從原基因座上表達(dá)整合的等位基因更合 適。
[0003] -些有關(guān)整合或敲除酵母基因座上等位基因的方法已有報(bào)道。其中的大多數(shù)方法 都需要在基等位基因整合后剔除一個選擇性或反向選擇性的篩選標(biāo)記。這使得以通過高通 量分析基因間相互作用來研究基因功能為專長的技術(shù)如合成遺傳陣列（synthetic genetic array，SGA)和基于基因芯片的合成致死陣列分析(diploid based synthetic lethality analysis on microarrays，dSLAM)變得無所適從。雖然PCR介導(dǎo)的標(biāo)記融合方 法能通過選擇性標(biāo)記來產(chǎn)生等位基因整合，但是由于基因的異質(zhì)性和相對較低的整合效 率，特別是這些標(biāo)記距離等位基因突變位置相對較遠(yuǎn)使得高通量基因研究難以進(jìn)行。
[0004] 最近，二倍體重組技術(shù)的興起使該問題得以解決，二倍體重組技術(shù)是一種實(shí)用性 強(qiáng)的技術(shù)，可用于基因敲除背景下的酵母等位基因整合。但該技術(shù)需要一些關(guān)鍵組件一一 整合卡盒，這種卡盒的5 '和3 '端各具有一半的KanMX模塊，中間的含有靶基因(Α0Ι)的側(cè)翼 序列和作為篩選標(biāo)記的URA3。整個卡盒通過基因克隆技術(shù)克隆到Τ0Ρ0克隆載體中，隨后通 過酶切將卡盒從Τ0Ρ0克隆中釋放出來。隨著卡盒被轉(zhuǎn)化至基因敲除背景下的酵母菌株 (AOI/aoi Δ : :kanMX)中，Α0Ι及URA3替換Α0Ι基因座上的KanMX序列，使突變菌株具備URA+同 時喪失kan抗性，從而獲得等位基因整合菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)及 其應(yīng)用，該質(zhì)粒系統(tǒng)用于釀酒酵母等位基因高效整合高效、便捷、高通量、適用范圍更廣。
[0006] 本發(fā)明的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括4種不同的釀 酒酵母等位基因整合質(zhì)粒分別為pDH735、pDH818、pDH824和pDH825;其中，pDH735攜帶的整 合卡盒為：pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF; pDH818 攜帶的整合卡盒為：pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF;pDH824 攜帶的整合卡盒為：pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF;pDH825 攜帶的整合卡盒為：pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF 〇
[0007] 所述質(zhì)粒pDH735是在質(zhì)粒pFA6a-kanMX及pDH734基礎(chǔ)上加以改造而來的。其中質(zhì) 粒PDH734是在pFA6a-kanMX基礎(chǔ)上，利用了不依賴基因序列和連接反應(yīng)的克隆技術(shù) (Sequence and Ligation Independent Cloning，SLIC)，導(dǎo)入了含有EM7啟動子及TRP1 啟 動子的 pTEF-pTRPl-kan-tTEF 卡盒。在 pDH734 基礎(chǔ)上，將質(zhì)粒 pD0NR221 中的 attPl-ccdB-CAT-attP2分成上、下游兩段分別克隆到pDH734的pTEF-pTRPl-kan-tTEF卡盒中，構(gòu)建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF 整合卡盒，所獲質(zhì)粒即為 pDH735。
[0008] 所述質(zhì)粒PDH818是在質(zhì)粒pFA6a-kanMX及PDH817基礎(chǔ)上加以改造而來的。其中 PDH817質(zhì)粒是在pDH734基礎(chǔ)上加以改造而來的，其pT啟動子僅含有pDH734上pTEF的前 148bp的序列。在pDH817質(zhì)?；A(chǔ)上，將質(zhì)粒pDH735中的attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到 質(zhì)粒PDH817中，構(gòu)建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF整合卡盒，所獲質(zhì)粒即 為PDH818。
[0009] 所述質(zhì)粒PDH824是在質(zhì)粒pAG25及pDH823基礎(chǔ)上加以改造而來的。利用SLIC技術(shù) 將ADH1啟動子克隆到pAG25中，構(gòu)建pTEF-pADHl-nat-tTEF卡盒，所獲質(zhì)粒命名為pDH823，在 PDH823質(zhì)?；A(chǔ)上，將質(zhì)粒pDH735中的attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到質(zhì)粒pDH823中， 構(gòu)建 pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF 整合卡盒，所獲質(zhì)粒即為 pDH824。
[0010] 所述質(zhì)粒PDH824是在質(zhì)粒pDH823基礎(chǔ)上加以改造而來的。將質(zhì)粒pDH818中的pT啟 動子及attPl-ccdB-CAT-attP2克隆到pDH823中，構(gòu)建pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF卡盒，所獲質(zhì)粒即為pDH825。
[0011] 本發(fā)明的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)的應(yīng)用，所述系統(tǒng)應(yīng)用于釀酒 酵母的等位基因高效整合。
[0012] 所述釀酒酵母的等位基因高效整合方法，包括：
[0013] (1)構(gòu)建4種基于不同用于釀酒酵母等位基因整合的卡盒的釀酒酵母等位基因整 合質(zhì)粒；
[0014] (2)將待研究的靶向基因及其側(cè)翼克隆到步驟(1)中的質(zhì)粒的整合卡盒中；
[0015] (3)針對基因敲除背景的酵母菌株，利用酶切將步驟(2)中的整合卡盒從質(zhì)粒中釋 放出來，轉(zhuǎn)入基因敲除背景的酵母菌株中進(jìn)行同源重組替換原敲除基因座上的篩選標(biāo)記基 因，并篩選鑒定；
[0016] 針對轉(zhuǎn)入非基因敲除背景的酵母菌株，設(shè)計(jì)兩對與內(nèi)源靶基因同向和反向的引 物，以攜帶相應(yīng)靶基因的高效整合質(zhì)粒為模板，利用PCR將攜帶有多個突變位點(diǎn)的靶基因的 卡盒擴(kuò)增出來，轉(zhuǎn)入非基因敲除背景的酵母菌株中，同向或反向的替換酵母基因組上的內(nèi) 源靶基因，并分別通過PCR檢測正確整合效率，同時檢測靶基因多個突變位點(diǎn)，分析完整性。
[0017] 所述步驟⑵中克隆方式為常規(guī)PCR克隆技術(shù)。
[0018] 所述步驟(3)中基因敲除背景的釀酒酵母菌株為產(chǎn)業(yè)化突變菌株，突變基因座上 具有pTEF和tTEF側(cè)翼的篩選標(biāo)記基因；所述酶切采用限制性內(nèi)切酶Notl;所述篩選標(biāo)記基 因包括URAMX;所述篩選為G418或NAT抗性培養(yǎng)基篩選;所述鑒定為轉(zhuǎn)化子發(fā)孢子所產(chǎn)生的 單倍體子代進(jìn)行抗G418或NAT表型鑒定;所述驗(yàn)證為URA缺陷培養(yǎng)基篩選驗(yàn)證。
[0019] 所述步驟(3)中同向的替換酵母基因組上的內(nèi)源靶基因時，用于獲得整合卡盒的 上游引物5 '末端與靶向基因上游序列互補(bǔ)，上游引物3 '末端與pTEF互補(bǔ)，下游引物5 '末端 與靶向基因下游序列互補(bǔ)，3'末端與tTEF序列互補(bǔ);所述反向的替換酵母基因組上的內(nèi)源 靶基因時，上游引物5'末端與靶向基因下游序列互補(bǔ)，下游引物5'末端與靶向基因上游序 列互補(bǔ)。
[0020] 所述引物的3 '末端與pTEF或tTEF配對的序列長度為20bp，引物的5 '末端與靶向基 因上下游配對的序列長度為40bp。
[0021] 所述步驟(3)中分析完整性是利用PCR技術(shù)檢測各陽性克隆中靶基因左右兩翼結(jié) 合位點(diǎn)的完整率。
[0022] 本發(fā)明的釀酒酵母的等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)用于基因高效整合，具體包括如 下步驟:設(shè)計(jì)并構(gòu)建4種含有不同酵母等位基因整合卡盒的質(zhì)粒;通過常規(guī)PCR克隆技術(shù)將 靶向基因及其側(cè)翼克隆到質(zhì)粒的整合卡盒中；針對基因敲除背景的酵母菌株，選擇常規(guī)限 制酶酶切技術(shù)將整合卡盒從質(zhì)粒中釋放出來，轉(zhuǎn)入基因敲除背景的酵母菌株中，篩選鑒定； 針對非基因敲除背景的酵母菌株，則選擇常規(guī)PCR技術(shù)將整合卡盒從質(zhì)粒中釋放出來，轉(zhuǎn)入 非基因敲除背景的酵母菌株中，篩選、驗(yàn)證及鑒定。該釀酒酵母的等位基因高效整合質(zhì)粒系 統(tǒng)能夠高效、精確的將待研究的等位基因整合到基因組中，該系統(tǒng)的應(yīng)用將改善現(xiàn)有的酵 母基因功能相關(guān)研究技術(shù)。
[0023] 本發(fā)明涉及基因整合載體的構(gòu)建，多種基因背景下的等位基因整合方法及菌種基 因工程改造;尤其是適用于釀酒酵母基因組的快速、大通量的等位基因整合方法。
[0024] 有益效果
[0025] 本發(fā)明的方法克服現(xiàn)有等位基因整合存在的不足，是一種高效、便捷、高通量、適 用范圍更廣的等位基因整合方法;尤其是適用于釀酒酵母基因組的快速、大通量的等位基 因整合。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明中4種等位基因整合的質(zhì)粒圖譜；
[0027]圖2為本發(fā)明中Α0Ι克隆到整合卡盒的多種途徑；
[0028] 圖3為本發(fā)明中基因敲除背景下的整合卡盒獲取途徑及整合方式；
[0029] 圖4為實(shí)施例5和實(shí)施例6中基因敲除背景下ecol和smc整合效率對比；
[0030] 圖5為本發(fā)明中非基因敲除背景下的整合卡盒獲取途徑及整合方式；
[0031]圖6為實(shí)施例7中非基因敲除背景下通過正反兩個方向整合ecol基因的完整性對 比。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授