1-N-F:
[0089] TACATATTAGGGTTCAACAGAATATAAATCGTTGCACAAACGTACGCTGCAGGTCGACECO1-N-R:
[0090] CATTTTTCCAGTGTCCCTTCTCGCTGTCTTTTCGAAAGAGATCGATGAATTCGAGCTCGTECO1-C-F:
[0091] TACATATTAGGGTTCAACAGAATATAAATCGTTGCACAAATCGATGAATTCGAGCTCGT
[0092] ECO1-C-R:CATTTTTCCAGTGTCCCTTCTCGCTGTCTTTTCGAAAGAGCGTACGCTGCAGGTCGAC
[0093] pTEF-NL-F:GCATACATGGTGCAAAATTATGG
[0094] pTEF-NL-R:GAAAGAAGAACCTCAGTGGC
[0095] pTEF-NR-F:GATGCTCGAT GAGTTTTTCTAA
[0096] pTEF-NR-R:CCAAAACGGTTCTAATACTATAG
[0097] tTEF-CL-F:GCATACATGGTGCAAAATTATGG
[0098] tTEF-CL-R:GATGCTCGATGAGTTTTTCTAA
[0099] tTEF-CR-F:5 ' GAAAGAAGAACCTCAGTGGC
[0100] tTEF-CR-R:5 ' CCAAAACGGTTCTAATACTATAG
[0101] ECO1-F:GCTACAACGGACATCAACAT
[0102] ECO1-R:TGCACTCTCAGTACAATCTGGTTTAG TTCCTCACCTTGTC
[0103] CX:GCTACAACGGACATCAACAT
[0104] 1、針對(duì)非基因敲除背景菌株EC01基因，分別設(shè)計(jì)以上兩對(duì)與EC01同向（EC01-N)和 反向（EC01-C)的引物，引物3'末端序列有20bp與pTEF(正向整合)或tTEF(反向整合)序列配 對(duì)，5'末端有~40bp的靶向基因序列。
[0105] 2、按照實(shí)施例5的方法，以質(zhì)粒攜帶有EC01及其側(cè)翼的PDH735及正向或反向兩對(duì) 引物將 pTEF-AOI-pTRPl-kan-tTEF 和 pTEF-AOI-pADHl-nat-tTE 擴(kuò)增下來。
[0106] 3、通過酵母轉(zhuǎn)化，將上述4個(gè)雙向整合的整合卡盒，各自轉(zhuǎn)化至非基因敲除背景菌 株中。
[0107] 4、通過G418或cloNAT抗性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，對(duì)于同向整合，獲得約500個(gè)G418抗性 的轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑選其中16轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，針對(duì)上下游結(jié)點(diǎn)選用引物pTEF-NL-F/R、 pTEF-CL-F/R、tTEF-NL-F/R、tTEF-CL-F/R進(jìn)行上下游完整性檢測(cè)，其中100 %為下游完整整 合，6.2%為上游完整整合。隨機(jī)挑選4個(gè)僅下游完整整合的轉(zhuǎn)化子，用引物EC01-F/R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對(duì)其PCR產(chǎn)物用引物CX進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)丟失了 L96S突變位點(diǎn)，1個(gè)同時(shí)丟失 了L96S和E177A突變位點(diǎn)，僅有兩個(gè)完整保留了三個(gè)突變位點(diǎn)。對(duì)于反向整合，獲得約200個(gè) G418抗性的轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑選16個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，100 %為上下游完整整合，隨機(jī)挑選 其中4的PCR產(chǎn)物用引物CX進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)所有的轉(zhuǎn)化子都保留了三個(gè)突變位點(diǎn)。圖6為本實(shí) 施例中非基因敲除背景下通過正反兩個(gè)方向整合ecol基因的完整性對(duì)比圖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括4種釀酒酵母 等位基因整合質(zhì)粒分別為pDH735、pDH818、pDH824和pDH825;其中，pDH735攜帶的整合卡盒 為：pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF;pDH818 攜帶的整合卡盒為：pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF; pDH824 攜帶的整合卡盒為：pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF;pDH825 攜帶的整合卡盒為：pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)，其特征在于，所述 PDH735的構(gòu)建方法包括： 將質(zhì)粒PD0NR221中的attPl-ccdB-CAT-attP2分成上、下游兩段分別克隆到pDH734的 pTEF-pTRPl-kan-tTEF卡盒中，構(gòu)建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF整合卡 盒，所獲質(zhì)粒即為PDH735; 所述PDH818的構(gòu)建方法包括:將質(zhì)粒pDH735中的attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到質(zhì) 粒PDH817中，構(gòu)建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF整合卡盒，所獲質(zhì)粒即為 PDH818； 所述PDH824的構(gòu)建方法包括:將質(zhì)粒pDH735中的attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到質(zhì) 粒PDH823中，構(gòu)建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF整合卡盒，所獲質(zhì)粒即為 PDH824； 所述PDH825的構(gòu)建方法包括:將質(zhì)粒pDH818中的pT啟動(dòng)子及attPl-ccdB-CAT-attP2克 隆到PDH823中，構(gòu)建pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF卡盒，所獲質(zhì)粒即為 PDH825； 其中，質(zhì)粒PDH734是在pFA6a-kanMX基礎(chǔ)上，導(dǎo)入了含有EM7啟動(dòng)子及TRP1啟動(dòng)子的 pTEF-pTRPl-kan-tTEF卡盒；pDH817質(zhì)粒是在pDH734基礎(chǔ)上改造得到，pT啟動(dòng)子僅含有 PDH734上pTEF的前148bp的序列；將ADH1啟動(dòng)子克隆到pAG25中，構(gòu)建pTEF-pADHl-nat-tTEF 卡盒，所獲質(zhì)粒命名為PDH823。3. -種如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于， 應(yīng)用于釀酒酵母的等位基因高效整合。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在 于，所述釀酒酵母的等位基因高效整合方法，包括： (1) 構(gòu)建4種基于不同用于釀酒酵母等位基因整合的卡盒的釀酒酵母等位基因整合質(zhì) 粒； (2) 將待研究的靶向基因及其側(cè)翼克隆到步驟(1)中的質(zhì)粒的整合卡盒中； (3) 針對(duì)基因敲除背景的酵母菌株，利用酶切將步驟(2)中的整合卡盒從質(zhì)粒中釋放出 來，轉(zhuǎn)入基因敲除背景的酵母菌株中進(jìn)行同源重組替換原敲除基因座上的篩選標(biāo)記基因， 并篩選鑒定； 針對(duì)轉(zhuǎn)入非基因敲除背景的酵母菌株，設(shè)計(jì)兩對(duì)與內(nèi)源靶基因同向和反向的引物，以 攜帶相應(yīng)靶基因的高效整合質(zhì)粒為模板，利用PCR將攜帶有多個(gè)突變位點(diǎn)的靶基因的卡盒 擴(kuò)增出來，轉(zhuǎn)入非基因敲除背景的酵母菌株中，同向或反向的替換酵母基因組上的內(nèi)源靶 基因，并分別通過PCR檢測(cè)正確整合效率，同時(shí)檢測(cè)靶基因多個(gè)突變位點(diǎn)，分析完整性。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在 于，所述步驟(2)中克隆方式為PCR克隆技術(shù)。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在 于，所述步驟(3)中基因敲除背景的釀酒酵母菌株的基因座上具有pTEF和tTEF側(cè)翼的篩選 標(biāo)記基因；所述酶切采用限制性內(nèi)切酶Notl;所述篩選標(biāo)記基因包括URAMX;所述篩選為 G418或NAT抗性培養(yǎng)基篩選;所述鑒定為轉(zhuǎn)化子發(fā)孢子所產(chǎn)生的單倍體子代進(jìn)行抗G418或 NAT表型鑒定;所述驗(yàn)證為URA缺陷培養(yǎng)基篩選驗(yàn)證。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在 于，所述步驟(3)中同向的替換酵母基因組上的內(nèi)源靶基因時(shí)，用于獲得整合卡盒的上游引 物5 '末端與靶向基因上游序列互補(bǔ)，上游引物3 '末端與pTEF互補(bǔ)，下游引物5 '末端與靶向 基因下游序列互補(bǔ)，3'末端與tTEF序列互補(bǔ);所述反向的替換酵母基因組上的內(nèi)源靶基因 時(shí)，上游引物5'末端與靶向基因下游序列互補(bǔ)，下游引物5'末端與靶向基因上游序列互補(bǔ)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在 于，所述引物的3'末端與pTEF或tTEF配對(duì)的序列長(zhǎng)度為20bp，引物的5'末端與靶向基因上 下游配對(duì)的序列長(zhǎng)度為40bp。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在 于，所述步驟(3)中分析完整性是利用PCR技術(shù)檢測(cè)各陽(yáng)性克隆中靶基因左右兩翼結(jié)合位點(diǎn) 的完整率。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種釀酒酵母等位基因高效整合質(zhì)粒系統(tǒng)及其應(yīng)用，所述系統(tǒng)包括4種釀酒酵母等位基因整合質(zhì)粒分別為pDH735、pDH818、pDH824和pDH825。所述系統(tǒng)應(yīng)用于釀酒酵母的等位基因高效整合，整合方法包括：構(gòu)建4種基于不同用于釀酒酵母等位基因整合的卡盒的釀酒酵母等位基因整合質(zhì)粒；將待研究的靶向基因及其側(cè)翼克隆到質(zhì)粒的整合卡盒中；將整合卡盒釋放或擴(kuò)增出來，轉(zhuǎn)入基因敲除背景或者非基因敲除背景的釀酒酵母菌株中，篩選鑒定整合效果。本發(fā)明高效、便捷、高通量、適用范圍更廣的等位基因整合方法；尤其是適用于釀酒酵母基因組的快速、大通量的等位基因整合。
【IPC分類】C12N15/81
【公開號(hào)】CN105602983
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610052533
【發(fā)明人】黃志偉, 房志家, 沈?；? 孟曉卿, 魏紅巖
【申請(qǐng)人】東華大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2016年1月26日