的多克隆位點，用 軟件P imerPr emi er設(shè)計引物。
[0019] 上游引物:5' CGGAATTCATGGCCCACAGCTCAGCA3'， 下游引物：5 ' GCTCTAGACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3 '。
[0020] 其中斜體劃線部分為引入的EcoRI位點Xbal位點。以質(zhì)粒p0RF-hIL-10為模板經(jīng) PCR擴(kuò)增hIL-10，PCR反應(yīng)條件為:50μ1反應(yīng)體系中，94°C，預(yù)變性10min，94°C變性45s，52°C， 退火45s，72°C，延伸lmin，35個循環(huán)，72°C延伸lOmiruPCR結(jié)束后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀 察擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，電泳結(jié)果可見PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，相對分子量大小約550bp。
[0021] 其中，圖2 :M:DL2，OOODNAmarker; 1:質(zhì)粒p0RF5-HIL為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022] 步驟2,構(gòu)建hIL-ΙΟ表達(dá)載體：使用EcoRI/Xbal對純化后的hIL-ΙΟ基因及質(zhì)粒 pPICZaA進(jìn)行雙酶切。用凝膠回收試劑盒分別回收目的片段，取?μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。并 以Τ4連接酶連接兩種目的片段得到連接產(chǎn)物。
[0023] 步驟3，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞:將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. col iDH5a，再將經(jīng)過轉(zhuǎn)化 的感受態(tài)E. col iDH5a涂布于含25ygAUZe〇cin的LB平板，待重組菌落形成后，挑取單個菌落 培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒作瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，hIL-ΙΟ基因的酶切產(chǎn)物呈單一條帶，相 對分子量大小約540bp結(jié)果如圖3所示;pPICZaA質(zhì)粒的酶切物相對分子量大在3500bp左右， 也為單一條帶結(jié)果如圖4所示。兩種酶切產(chǎn)物的連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化E. col iDH5a后，抽提重組質(zhì) 粒在1.2%瓊脂糖凝膠電泳后顯示為4100bp左右的條帶結(jié)果如圖5所示。
[0024] 其中，圖3:MA-HindmDNAmarker;l:hIL-10基因經(jīng)EcoRI/Xbal雙酶切的產(chǎn)物。
[0025] 圖 4:MA-HindmDNAmarker;l:質(zhì)粒 pPICZaA 經(jīng) EcoRI/Xbal 雙酶切的產(chǎn)物； 圖5:MA-HindmDNAmarker;l:重組質(zhì)粒 pPICZaA-hILlO。
[0026] 步驟4，重組質(zhì)粒測序鑒定：以EcoRI/Xbal對所提質(zhì)粒做雙酶切，然后進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳觀察，進(jìn)行DNA檢序。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/Xbal酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示為同一 泳道上3500bp左右和540bp左右的兩種片段結(jié)果如圖6所示;重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序，結(jié)果顯示 與Genbank中報道的hIL-ΙΟ基因序列一致結(jié)果如圖7所示。
[0027] 其中，圖6:M1 A-HindniDNAmarker; M2：DL2 ? OOODNAmarker； Ml：A-HindniDNAMarker〇
[0028] 步驟5,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33菌株重組酵母菌的篩選：以重組質(zhì)粒pPICZaA-hIL-10 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母X-33,所得產(chǎn)物涂布于含Zeocin濃度為50~1000μg/ml的YPDS平板， 平板上形成的菌落即為重組酵母菌；當(dāng)Zeocin濃度為50μg/ml時，YPDS平板上形成菌落為整 個平板的1/2，當(dāng)Zeocin濃度增加到100μg/ml時，YPDS平板上形成菌落長滿整個平板，當(dāng) Zeocin濃度增加到1000μg/ml，每個平板只篩選到了近20個菌落結(jié)果如圖8所示，每個重組 菌落均擴(kuò)增出與目的基因同等大小的條帶結(jié)果如圖9所示。以lOOμg/mlZeocin濃度的YPDS 平板篩選到的重組菌落保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 其中，圖8:A:用100μg/mlZeocin培養(yǎng)基篩選所得重組酵母;B:用1000μg/mlZeocin 培養(yǎng)基篩選所得重組酵母。
[0030] 圖9:M:100bp的DNALadderPlus; 1:質(zhì)粒pPICZaA經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物 2~13:12個的重組酵母菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物。
[0031 ] 步驟6，rhIL-10蛋白表達(dá)及鑒定試劑配制： 一、rhIL-10蛋白表達(dá)試劑及配制： (1) 10 X YNB(含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基）：134g酵母基礎(chǔ)氮源 培養(yǎng)基(無硫酸銨)+1 〇〇g硫酸銨，溶于1 〇〇〇ml水中，過濾除菌，4°C保存。
[0032] (2) 10 XM(5%Methanol甲醇）：將5ml的甲醇與95ml水混勻，過濾除菌。
[0033] (3)500\8(0.02%生物素祀〇丨丨11)4°(：保存保存期為1年。2011^的生物素于1001111純 水中，過濾除菌。
[0034] (4)100\汛0.4%把8乜乜1^組氨酸）4°(：保存。40011^的1^-組氨酸溶于1001111水中，加 熱至50°C以促進(jìn)溶解，過濾除菌。
[0035] (5)10 XD(20%Dextrose葡萄糖）：200g葡萄糖溶于1000ml純水中，滅菌15min或過 濾除菌。
[0036] (6)10 XGY(10%Glycerol甘油）：將100ml甘油和900ml純水混勻后，高壓滅菌或過 濾除菌。
[0037] (7)謂磷酸鉀緩沖液（口<^&8 8；[111]^)11〇8口11&七6131^€61'4!16.0):將11]1〇1凡的1(2]^：)04溶 液132ml與lmol/L的KH2P04溶液868ml混勻，使用磷酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH到6.0。
[0038] 二、rhIL-10蛋白分析鑒定試劑及配制： (1 )2 X SDS-PAGE上樣緩沖液：取0 · 5mol/LTris-HCl(pH6 · 8)2ml，甘油2ml，20%SDS2ml， 0.1%溴酚藍(lán)0.5ml，β-巰基乙醇lml，雙蒸水2.5ml混勻。
[0039] (2)30%丙烯酰胺溶液:稱取IgN，N-亞甲基雙丙烯酰胺，先在蒸餾水中加熱溶解，再 加入29g丙烯酰胺，雙蒸水溶解，定容至100ml，避光保存。
[0040] (3)1.5mol/L(pH8.8)的Tris-HCl緩沖液:Trisl8.2g溶于95ml水中，用濃鹽酸調(diào)pH 至8.8,加水定容至100ml。
[0041 ] (4)lmol/L(pH6.8)Tris-HCl 緩沖液:Trisl2.10g 溶于 95ml 水中，用濃鹽酸調(diào)至 pH6.8,加水定容至100ml。
[0042] (5)5 X SDS-PAGE電泳緩沖液：Trisl5 . lg，甘氨酸94g，10% SDS50ml，加雙蒸水溶 解，定容至1000ml。使用時稀釋5倍。
[0043] (6)10%(w/v)SDS溶液：10gSDS溶于100ml蒸餾水中，室溫保存。
[0044] (7)10%(w/v)過硫酸銨(AP):0.1g(NH4)2S04 溶于 lml 蒸餾水中。
[0045] (8)12%分離膠：量取4.91111水，6.〇111130%丙烯酰胺溶液，3.811111.5111〇1/11^8-?：1 (pH8 · 8)，0 · 15ml 10%SDS，0 · 15ml 10%過硫酸銨，0 · 006mlTEMED。
[0046] (9)5% 濃縮膠:量取 3 · 4ml水，0 · 83ml30% 丙烯酰胺溶液，0 · 638ml 1 · Omol/LTris-HCl (pH6 · 8)，0 · 05ml 10%SDS，0 · 05ml 10%過硫酸銨，0 · 005mlTEMED。
[0047] (10)脫色液:量取300ml甲醇、100ml冰乙酸，加雙蒸水定容至1000ml。
[0048] (11)0.2%的考馬斯亮藍(lán)R-250:0.2g考馬斯亮藍(lán)R-250，甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸 餾水40ml。
[0049] (12)轉(zhuǎn)膜緩沖液:Trisl.45g，甘氨酸7.2g，甲醇200ml，SDS0.37g，加水至 1000ml。
[0050] 步驟7，rhIL-10的誘導(dǎo)表達(dá):a、挑取經(jīng)步驟5篩選到的重組酵母菌，接種于2mlYPD 液體培養(yǎng)基中，30°C，250~300r/min振蕩培養(yǎng)24h; b、 按1:100ml比例，取24h培養(yǎng)物接種于BMGY培養(yǎng)基中，30°C，發(fā)酵培養(yǎng)至0D600達(dá)到 5.0； c、 取發(fā)酵培養(yǎng)菌液按5000r/min常溫離心5min，收集菌體，棄上清； d、 按1: 4ml比例，加入無菌水洗滌1次，5000r/min離心5min，棄上清，收集沉淀菌體； e、 菌體以BMMY培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)入PH值5.5~7.5、發(fā)酵溫度26~28 °C發(fā)酵培養(yǎng)，以終濃度為 0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)； f、 每12h取lml誘導(dǎo)培養(yǎng)液，離心后分離上清和菌體，上清和菌體于負(fù)20 °C冷凍保存，同 時向剩余的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中補(bǔ)加培養(yǎng)液和甲醇； g、 4天后停止誘導(dǎo)，5000r/min離心5min，收集上清和菌體； 步驟8，rhIL-10的檢測： (1)染色檢測：取不同時間段培養(yǎng)液作SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)R250染色。以甲醇誘導(dǎo) 12h~60h各個時段的上清，在分子量大小約為40KD處均有一條較清晰的蛋白條帶，但36h條 帶最為清晰濃染，以后逐漸變淡。凝膠中可見少量其他蛋白條帶。
[0051 ] (2)ELASA法檢測:根據(jù)IL-10標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以ELISA法測定36h時段培養(yǎng)液中 的rhIL-ΙΟ濃度。經(jīng)ELASA法檢測，當(dāng)發(fā)酵上清作5 X 10_5稀釋時，0D595 = 0 · 821，處于hIL-10 標(biāo)準(zhǔn)品的〇D595值范圍內(nèi)，并與濃度為1000pg/ml的hIL-10標(biāo)準(zhǔn)品的0D595值相同。標(biāo)準(zhǔn)品與樣 品測量結(jié)果換算發(fā)酵上清原液中rhIL-10的濃度為20mg/L。所以rhIL-10在發(fā)酵上清中總蛋 白的比例為40%。
[0052] (3)Bradford法檢測：以Bradford法檢測同時段培養(yǎng)液總蛋白濃度:發(fā)酵上清液經(jīng) Bradford法檢測，只有1:100稀釋管和1:80稀釋管所得A595值在標(biāo)準(zhǔn)蛋白的A595值的范圍內(nèi)， 檢測結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度對A 595值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查詢并計算所測樣品濃度為 0·05mg/ml，即50mg/l。
[0053] 步驟9,分離、Westernblot鑒定：以步驟8中36h時段的發(fā)酵上清液作SDS-PAGE后進(jìn) 行Westernblot分析，所得結(jié)果見圖10。在相對分子量40KD處有特異性蛋白條帶，沒有雜蛋 白條帶，但可見包括蛋白質(zhì)Marker在內(nèi)的所有蛋白條帶位置均偏向上樣一端。
[0054] 其中，圖10:1:空質(zhì)粒酵母菌pPICZaa-x-33經(jīng)誘導(dǎo)36h的上清液； 2~3:重組酵母菌pPICZaA-IL-10-X-33經(jīng)誘導(dǎo)24h和36h的上清液。
[0055]步驟10，rhIL-10制備完成，分裝保存。
[0056] 溫度控制、p