H值控制、蛋白酶抑制劑控制的過程以及鑒定步驟： 1.步驟7中rhIL-ΙΟ的誘導(dǎo)表達(dá)的溫度控制： (1)挑取單個重組酵母菌落于2πι1ΥΗ)液體培養(yǎng)基中，30 °C，250~300r/min振蕩過夜； (2 )取lml過夜培養(yǎng)物于100ml BMGY培養(yǎng)基中，30 °C轉(zhuǎn)速培養(yǎng)至0D6q()=5.0; (3) 5000r/min常溫離心5min，收集菌體，棄上清； (4) 加入50ml無菌水洗滌1次，5000r/min離心5min，棄上清，收集菌體； (5) 加入90mlBMMY培養(yǎng)基重懸所收集的菌體，按30ml/瓶轉(zhuǎn)于3個250ml無菌錐形瓶中， 分別放于26°C，27°C，28°C孵箱，200r/min振蕩培養(yǎng)； (6) 每間隔12h加入甲醇至終濃度0.5%，誘導(dǎo)36h后收集的培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0057] 實驗結(jié)果如圖11所示:其中，M:蛋白質(zhì)mareker; 1~3:pPICZaA-hIL-10-X-33在溫度為26°C，27°C和28°C誘導(dǎo)36小時的上清液； 4:pPICZaA-X-33溫度為37°C時誘導(dǎo)36h的上清液。
[0058] 2.步驟7中rhIL-ΙΟ的誘導(dǎo)表達(dá)的pH值控制： 確定蛋白表達(dá)最佳溫度后，在誘導(dǎo)表達(dá)的環(huán)節(jié)，分別在不同pH值5.5,6.0,6.5,7.0,7.5 的BMMY培養(yǎng)基重懸所收集的重組酵母菌，按30ml/瓶轉(zhuǎn)于6個250ml無菌錐形瓶中，分別放于 27 °C孵箱，200r/min振蕩培養(yǎng);每間隔12h加入甲醇至終濃度0.5%，誘導(dǎo)36h后收集培養(yǎng)上清 進(jìn)行SDS-PAGE分析，拍照記錄各個pH條件下蛋白表達(dá)結(jié)果。
[0059] 實驗結(jié)果如圖12所示:其中，1 :pPICZa-A-X_33在pH值是6.0誘導(dǎo)36h的上清液 2~6: pPICZaA-hIL-10-X-33 在 PH 值分別為 5 ·0,5·5,6·0,6·5,7· 0 誘導(dǎo) 36h 的上清液。 [0060] 3.步驟7中rhIL-ΙΟ的誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白酶抑制劑控制： 在誘導(dǎo)表達(dá)的環(huán)節(jié)，在用于表達(dá)的BMMY培養(yǎng)基中加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟化物 (phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)至終濃度為8·5mM，放于27°C孵箱200r/min振蕩 培養(yǎng)，同時設(shè)不加 PMSF的對照，每間隔12h加入甲醇至終濃度0.5%，誘導(dǎo)36h后收集培養(yǎng)上清 進(jìn)行SDS-PAGE分析，對實驗結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。
[0061 ]實驗結(jié)果如圖13所不:其中，M:蛋白質(zhì)標(biāo)記； 1: pPICZaA-hIL-10-X-33在沒有PMSF培養(yǎng)基誘導(dǎo)36h的上清液； 2:pPICZaA-hIL-10-X-33 在含 8.5umol/LPMSF 培養(yǎng)基誘導(dǎo) 36h 的上清液。
[0062] 4.rhIL-10 鑒定： 4. l、Bradford法定量總蛋白： (1)取13支試管，1支作空白管，6支作標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋管，6支作樣品稀釋管(表1)。在空白 對照管加0. lml水和2.0ml考馬斯亮蘭G-250試劑。
[0063] 表1標(biāo)準(zhǔn)蛋白測量表：
2 )在各標(biāo)準(zhǔn)管分別加入1. Omg/ml的牛血清白蛋白溶液Ο、0.01、0.03、0.05、0.07、 0.09ml，然后用無離子水補充到0. lml，最后各試管中分別加入2. Oml考馬斯亮蘭G-250試 劑。每加完一管，立即在旋禍混合器上混勾。將樣品按原液、1:10、1:20、1:40、1:80、1:100稀 釋后，各取1〇〇μ1到各樣品管，加入2ml的考馬斯亮蘭溶液并及時混勻。待測樣品的加樣見表 2〇
[0064] 表2樣品測量表：
(3)混勻后2~5分鐘，以空白對照管調(diào)零，測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白和樣品在595nm處的光吸收值 A595〇
[0065] (4)以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度(mg/ml)為橫座標(biāo)，A595值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線查出各稀釋樣品濃度，并換算為樣品原液濃度。
[0066] 4 · 2、SDS-PAGE 分析 rhIL-ΙΟ 表達(dá)水平： (1) 按說明裝好蛋白垂直電泳槽； (2) 灌制12%分離膠:將分離膠溶液緩慢加入玻璃板之間，至液面到距梳子下緣線lcm 處。然后用吸管小心地在分離膠溶上覆蓋一層水，室溫下靜置30min直至凝膠聚合； (3) 灌制積層膠:待分離膠完全聚合后配制5%積層膠，將分離膠上的水倒掉，并用水沖 洗分離膠的上表面，用濾紙吸去殘液。用吸管在玻璃板間加滿積層膠溶液，插入梳子，室溫 下凝聚，插上梳子； (4) 樣品處理:將不同時段收集的上清以丙酮沉淀法濃縮50倍，取50μ1濃縮液與等體積 2 X SDS上樣緩沖液于蓋上打孔的ΕΡ管中混勻，沸水浴中放置5min~lOmin。
[0067] (5)上樣:待積層膠完全聚合后，撥去梳子，加入SDS甘氨酸電泳緩沖液并清理上樣 孔，將準(zhǔn)備好的樣品按預(yù)定順序加入上樣孔中； (6) 電泳:接通電源，以80V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后轉(zhuǎn)換為120V恒壓繼續(xù)電泳 約2h; (7) 結(jié)果觀察：電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部，關(guān)閉電源取出凝膠，室溫下考馬斯亮藍(lán) R-250或G-250染色液染色15min，然后以三蒸水于微波爐內(nèi)中火加熱脫色2~3次（lOmin/ 次），后觀察蛋白條帶并拍照。
[0068] 4.3、Westernblot鑒定目的蛋白： (1)以不同時段的發(fā)酵上清作SDS-PAGE后，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。
[0069] (2)切一張7.3X8.6cm的硝酸纖維素膜，并將切好的硝酸纖維素膜置于蒸餾水中 浸泡2h后使用。
[0070] (3)在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、6張濾 紙。
[0071] (4)將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以 搟走里面的氣泡，再放上3張濾紙，并搟走氣泡。
[0072] (5)將凝膠從電泳槽取出，并從玻璃板上剝離，將濃縮膠輕輕刮去。將剝下的分離 膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，并用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個 膠并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下合起夾子。 [0073] (6)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，并放一塊冰來降溫。100V恒壓轉(zhuǎn)移lh。
[0074] (7)封閉：將膜取出，用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下?lián)u 床上搖動封閉lh。
[0075] (8)將鼠抗His單抗(一抗）用5%脫脂奶粉稀釋至適當(dāng)濃度（1:1000);撕下適當(dāng)大小 的一塊保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮 膜上;從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜 四角以趕出殘留氣泡;室溫下孵育60min后，用TBST在室溫下?lián)u床上洗兩次，lOmin/次;再用 TBS洗lOmin。
[0076] (9)同上方法準(zhǔn)備羊抗鼠酶標(biāo)抗體(二抗)稀釋液（1:4000)并與膜充分接觸，室溫 下孵育90min后，用TBST在室溫下?lián)u床上洗滌兩次，（lOmin/次）；再用TBS洗一次，lOmin。
[0077] (10)將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；lmin后，將膜蛋白面朝下與此混合 液充分接觸;lmin后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X光片夾中。
[0078] (11)在暗室中，將1 X顯影液和定影液分別倒入塑料盤中；在暗室中取出X光片，用 切紙刀剪裁至合適大小;打開X光片夾，把X光片放在膜上，關(guān)上X光片夾，開始計時;根據(jù)信 號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間；曝光完成后，打開X光片夾，取出X光片，迅速浸入顯影液中1~ 2min，終止顯影。馬上把X光片浸入定影液中，定影，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的 定影液后，室溫下晾干，對膠片進(jìn)行拍照。
[0079] 4.4、ELASA法分析rhIL-ΙΟ表達(dá)水平和抗原性： (1) 從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板孔，其他板孔密封放回4°C; (2) 除空白孔外，將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100μΙ加入相應(yīng)孔中，膠紙封板，37°C孵育 90min，洗板5次； (3) 加入生物素化抗體工作液（100μ1/孔），用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育 60min，洗板5次； (4) 加入酶結(jié)合物工作液(100μ1/孔），用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育30min，洗 板5次； (5) 加入顯色劑（100μΙ/孔），避光37°C孵箱孵育lOmin~15min; (6) 加入終止液（100μ1/孔），混勻后立即測量0D450值(5min內(nèi)）。
[0080] (7 )每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的0D450值=該孔0D450值一零標(biāo)準(zhǔn)品孔0D450值，以標(biāo)準(zhǔn)品 濃度為橫坐標(biāo)，0D450值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)0D450值查出樣品對應(yīng) 濃度。
[0081] 實施例2:在家兔抗皮膚移植排斥反應(yīng)中的應(yīng)用 1. rhIL-ΙΟ抗家兔皮膚移植應(yīng)用： (1)家兔皮膚移植模型條件的優(yōu)化，每只家兔的背部右側(cè)制備三個受片區(qū)，去皮，面積 為1.5 XI. 5cm2,邊緣齊整。取皮時以創(chuàng)面上出現(xiàn)許多密集而細(xì)小的出血點為宜。皮片厚度 最佳為10~15mm含真皮層中厚皮片，皮片去基膜，修齊;手術(shù)時間與存活時間密切相關(guān)， 30min以內(nèi)手術(shù)時間有利于皮片的存活。
[0082] (2)家兔皮膚移植實驗從移植前一天給藥，連續(xù)10天。
[0083] (3)用藥劑量及方法:第一組rhIL-ΙΟ用量10yg/kg/d，肌肉注射;第二組rhIL-ΙΟ用 量5yg/kg/d，聯(lián)合用CsA5mg/kg/d，肌肉注射。陽性對照CsA5mg/kg/d，肌肉注射，空白（陰性 對照)NS肌肉注射。
[0084] 2.抗家兔皮膚移植應(yīng)用效果： (1) 皮膚開始出現(xiàn)排斥時間：rhIL-ΙΟ組第9天，rhIL-10+CsA組第16天，陽性對照CsA組 第12天，空白（陰性對照)NS組第4天。結(jié)果表明rhIL-ΙΟ有明顯抑制皮膚移植排斥，與CsA聯(lián) 合應(yīng)用有增強效果。結(jié)果見表3。
[0085]表3家兔移植皮片開始出現(xiàn)排斥反應(yīng)時間及存活時間（）
(2) 皮片存活時間：rhIL-10組存活至第16天，rhIL-10+CsA組存活至第19天，陽性對照 CsA組存活至第15天，空白（陰性對照)NS組存活至第7天。結(jié)果表明rhIL-ΙΟ有明顯抑制皮膚 移植排斥，與CsA聯(lián)合應(yīng)用有增強效果。見圖14和表3。
[0086] (3)IL-4、TNF-a細(xì)胞因子檢測結(jié)果：IL-4檢測rhIL-ΙΟ組術(shù)前1天與14天分別是 29.12±0.84、113.81±0.92，^1幾 -10+〇8八組第0天與14天分別是31.41±0.92、89.92± 0.53;丁嚦-〇檢測濁11^-10組術(shù)前1天與14天分別是9.79±0.30、16.64±0.96，濁11^-10+〇8八 組第0天與14天分別是9.03 ±0.57、19.62 ±2.47。結(jié)果表明Th2細(xì)胞分泌IL-4細(xì)胞因子抑制 Thl細(xì)胞分泌TNF-a實現(xiàn)抑制皮膚排斥反