SEQ ID No. 1的啟動子控制下的報告蛋白的 活性的至少50%或55%，優(yōu)選至少60、65或70%，更優(yōu)選至少75%、80%、85%或90%，最 優(yōu)選至少92、94、96、98或99%。
[0139] 用RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少一個基因的天然啟 動子將導(dǎo)致有效連接到RIB7啟動子的編碼序列（即編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的 序列）的表達(dá)減少。
[0140] 在優(yōu)選的實施方案中，如上所述的表達(dá)減少可以導(dǎo)致有效連接到RIB7啟動子 的基因的轉(zhuǎn)錄率比對照生物體降低約5 %、8 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%或在這些值之間的任何值。在優(yōu)選的實施方案中，這種基因轉(zhuǎn)錄率的降低可以提供用 于編碼ADE12、SHM2和BAS1中至少其一的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，更優(yōu)選根據(jù)SEQ ID No. 10、 12和14的核苷酸序列中至少之一或如本文所定義的同源序列。
[0141] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，表達(dá)減少可以導(dǎo)致有效連接到RIB7啟動子的基因 的 mRNA 的量比對照生物體減少約 5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 或在這些值之間的任何值。在優(yōu)選的實施方案中，這種基因的mRNA的量減少可以提供用于 編碼ADE12、SHM2和BAS1中至少其一的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，更優(yōu)選根據(jù)SEQ ID No. 10、12 和14的核苷酸序列中至少之一或如本文所定義的同源序列。
[0142] 在又一個優(yōu)選的實施方案中，表達(dá)減少可以導(dǎo)致由有效連接到RIB7啟動子的基 因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)的量比對照生物體減少約5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%或在這些值之間的任何值。在優(yōu)選的實施方案中，這樣的由基因所編碼 的多肽或蛋白質(zhì)的量的減少可以提供用于ADE12、SHM2和BAS1中至少其一，更優(yōu)選根據(jù)SEQ ID No. 9、11和13的氨基酸序列中至少之一或如本文所定義的同源序列。
[0143] 如本文所用的術(shù)語"對照生物體"旨在包括野生型生物體，即不具有任何遺傳修飾 的生物體，和具有一個或多個除了本發(fā)明的遺傳修飾之外的遺傳修飾的生物體。優(yōu)選地，對 照生物體是用作本發(fā)明的遺傳修飾的起始生物體的生物體。
[0144] 為了用RIB7啟動子替代基因的天然啟動子所進(jìn)行的遺傳修飾可以通過本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的任何適當(dāng)?shù)姆椒▉磉M(jìn)行。
[0145] 可用于此上下文中的典型的方法是靶向同源重組。例如，RIB7啟動子的側(cè)翼可以 是與內(nèi)源性靶多核苷酸序列（即基因的天然啟動子，在其位置應(yīng)該發(fā)生插入）同源的DNA。 這樣的構(gòu)建體可以具有或沒有選擇標(biāo)記和/或具有或沒有陰性選擇標(biāo)記來轉(zhuǎn)化假囊酵母 屬細(xì)胞。通過靶向同源重組而進(jìn)行的DNA構(gòu)建體的插入導(dǎo)致RIB7啟動子替代基因的天然 啟動子被插入。
[0146] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指的是遺傳元件，通常是核酸分子（例如包含用于同源重組的構(gòu)建體 的特定盒），或者是染色體外元件（例如載體或質(zhì)粒）轉(zhuǎn)移到假囊酵母屬細(xì)胞，即進(jìn)入如上 文所限定的假囊酵母屬的生物體中，其中所述轉(zhuǎn)移造成基因穩(wěn)定的遺傳。假囊酵母屬細(xì)胞 轉(zhuǎn)化條件和相應(yīng)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些技術(shù)包括化學(xué)轉(zhuǎn)化，優(yōu)選乙酸鋰轉(zhuǎn) 化，如，例如，獲取自 Jimenez 等人（2005) Appl. Environ. Microbiol. 71 :5743-5751，原生質(zhì) 體融合，彈道沖擊轉(zhuǎn)化，電穿孔，顯微注射，或任何其他將目的基因或核酸分子導(dǎo)入真菌細(xì) 胞的方法。
[0147] 優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以通過選擇在引入的遺傳元件上包含的標(biāo)記來進(jìn)行鑒定。 備選地，單獨的標(biāo)記構(gòu)建體可以與所需的遺傳元件共轉(zhuǎn)化。通常，可選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在選 擇培養(yǎng)基上生長的能力。選擇培養(yǎng)基可摻入抗生素或缺乏對未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長所必需的因 子，例如營養(yǎng)或生長因子。導(dǎo)入的標(biāo)記基因可賦予抗生素抗性，或編碼必需的生長因子或 酶，從而當(dāng)在轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)時，允許在選擇培養(yǎng)基上生長。如果可以直接或間接地檢測 被表達(dá)的標(biāo)記蛋白，那么可通過檢測標(biāo)記蛋白來選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
[0148] 標(biāo)記蛋白可以單獨表達(dá)或與另一種蛋白質(zhì)融合表達(dá)。標(biāo)記蛋白可以被檢測，例如， 通過其酶活性。備選地，抗體可用于檢測標(biāo)記蛋白，或者例如，目的蛋白上的分子標(biāo)簽。表達(dá) 標(biāo)記蛋白或標(biāo)簽的細(xì)胞可以例如通過視覺，或通過諸如FACS或使用抗體的淘選技術(shù)來選 擇。優(yōu)選地，也可以使用任何在假囊酵母屬的細(xì)胞中發(fā)揮功能的適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的。更優(yōu)選地，可采用提供抗卡那霉素、潮霉素、氨基糖苷G418或諾爾絲菌素（也 稱為NTC或ClonNAT)抗性，以及具有在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸或色 氨酸的培養(yǎng)基上生長能力的標(biāo)記。
[0149] 當(dāng)使用如上所述的選擇標(biāo)記，如G418或ClonNAT抗性標(biāo)記，或者任何其他合適的 標(biāo)記時，可使用Cre-lox體系的序列，其是標(biāo)記兩端的側(cè)翼。在Cre重組酶表達(dá)時，該體系 允許在構(gòu)建體插入后的選擇標(biāo)記消除和隨后的再利用。還設(shè)想的是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的其他類似的重組酶體系。
[0150] 在具體的實施方案中，標(biāo)記也可以與位點特異性核酸酶的靶位點結(jié)合，如鋅指核 酸酶（ZFN)或能夠在體內(nèi)切割特異的DNA靶序列的大范圍核酸酶。這種體系的具體的例 子是TALEN(轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶）體系，即人工限制酶，它是由將TAL效應(yīng)子DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA切割結(jié)構(gòu)域融合產(chǎn)生的。TAL效應(yīng)子是通常由黃單胞菌或相關(guān)物種分泌 的，或由其衍生的并已被修飾的蛋白質(zhì)。TAL效應(yīng)子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含高度保守的序 列，例如約33-34個氨基酸，除了高度可變的第12和第13個氨基酸（重復(fù)可變區(qū)（Repeat Variable Diresidue)或RVD)，并且通常顯示出與特定核苷酸識別的很強的相關(guān)性。在這 個原則的基礎(chǔ)上，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過選擇含有對應(yīng)于靶基因 DNA序列的重復(fù)可變區(qū) 的重復(fù)節(jié)段的組合來設(shè)計。TALEN DNA切割結(jié)構(gòu)域可以衍生自合適的核酸酶。例如，可使 用來自FokI內(nèi)切核酸酶或者來自FokI內(nèi)切核酸酶變體的DNA切割結(jié)構(gòu)域來構(gòu)建雜交核酸 酶。由于以二聚體發(fā)揮功能的FokI結(jié)構(gòu)域的特殊性，TALEN可以優(yōu)選地提供為獨立的實體。
[0151] 在具體的實施方案中，TALEN DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和FokI切割結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸 殘基數(shù)目和兩個個體TALEN結(jié)合位點之間的堿基數(shù)目可以根據(jù)插入到假囊酵母屬基因組 中的構(gòu)建體的序列進(jìn)行修飾或優(yōu)化，以提供高水平的活性。TALENS或TALEN組分可被工程 改造或修飾，以靶向任何所需的DNA序列，如包括在要插入到生物體的基因組中的基因的 同源端之間的選擇標(biāo)記的DNA序列。重組所需的酶活性可以或者按這樣提供（例如類似 于在假囊酵母屬中已建立的REMI法），或者它可以與在構(gòu)建體中的選擇盒一起提供，導(dǎo)致 其在核酸酶活性開始時被除去。工程改造可以按照適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行，例如描述于Zhang等 人（2011)Nature Biotechnol 29 :143-148 或 Reyon 等人（2012)Nature Biotechnol 30: 460-465〇
[0152] 另一種用于從假囊酵母屬細(xì)胞的基因組中除去標(biāo)記序列的系統(tǒng)是CRISPR(規(guī)律 成簇間隔短回文重復(fù)）/CAS (CRISPR關(guān)聯(lián)的）系統(tǒng)，其已經(jīng)顯示出促進(jìn)RNA指導(dǎo)的位點特異 性DNA切割并且其可以用于基因組工程改造（參見，例如，Sander and Young(2014)Nature Biotechnol. 32 :347-355)。該系統(tǒng)采用Cas9作為核酸酶，其由crRNA和tracrRNA指導(dǎo)來 切割特定的DNA序列。成熟的crRNA :tracrRNA復(fù)合物經(jīng)由在crRNA上的間隔序列和在靶 DNA上的前間區(qū)序列（protospacer)之間的堿基配對，將Cas9引導(dǎo)至革EDNA，所述革EDNA田比 鄰前間區(qū)序列鄰近基序（PAM)。Cas9然后介導(dǎo)靶DNA的切割以產(chǎn)生前間區(qū)序列內(nèi)的雙鏈斷 裂。代替crRNA和tracrRNA，可將導(dǎo)向RNA設(shè)計成包括模仿tracrRNA-crRNA復(fù)合物的發(fā)夾 (Jinek 等人（2012) Science 337(6096) :816-821)〇
[0153] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，可以按在下文的實施例中的描述進(jìn)行同源重 組。特別優(yōu)選的是使用轉(zhuǎn)化盒，其包含G418或ClonNAT抗性標(biāo)記與ΙοχΡ序列的組合，如下 所述。
[0154] 典型地，遺傳元件可以在轉(zhuǎn)化盒或表達(dá)盒的幫助下被引入到假囊酵母屬細(xì)胞中。 按照本發(fā)明，術(shù)語"轉(zhuǎn)化盒"指的是含有外源基因，并且除了外源基因外還具有促進(jìn)假囊酵 母屬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體。術(shù)語"表達(dá)盒"指的是含有外源基因并且除了外源基因 外還具有使該基因在外源宿主（特別是在假囊酵母屬細(xì)胞）中的表達(dá)的元件的特定載體。
[0155] 可在采用如上文定義的表達(dá)盒或轉(zhuǎn)化盒的形式的遺傳元件上相應(yīng)地提供RIB7啟 動子，特別是制備用于通過同源重組而進(jìn)行基因組整合的表達(dá)盒或轉(zhuǎn)化盒。還設(shè)想的是提 供質(zhì)粒或載體。術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"指的是經(jīng)常攜帶不屬于細(xì)胞中心代謝部分的基因，并 且常常是環(huán)狀雙鏈DNA片段形式的染色體外元件。更優(yōu)選地，術(shù)語質(zhì)粒指的是適于本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的假囊酵母屬轉(zhuǎn)化，特別是適合于在假囊酵母屬中表達(dá)蛋白質(zhì)的任何質(zhì)粒， 例如能夠在其他生物體（優(yōu)選細(xì)菌，特別是大腸桿菌）中自主復(fù)制的質(zhì)粒，并且其可以被制 備，例如被消化用于假囊酵母屬的基因組插入轉(zhuǎn)化。
[0156] 在具體的實施方案中，遺傳元件可以包括微生物表達(dá)系統(tǒng)。此類表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá) 載體可以包含指導(dǎo)外源蛋白的高水平表達(dá)的調(diào)控序列。
[0157] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，如上文所定義的遺傳修飾的生物體，例如，包括用 RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的基因的天然啟動子的修飾的生物體， 能夠比沒有本發(fā)明的遺傳修飾的對照生物體累積更多的核黃素。如本文所用的術(shù)語"對照 生物體"指的是與用作遺傳修飾的起始生物體的生物體具有相同或非常相似的遺傳背景的 生物體。優(yōu)選地，對照生物體可以是用于如本文所述的遺傳修飾的生物體。如果遺傳修飾 是在野生型生物體中進(jìn)行，該野生型生物體可以被認(rèn)為是對照生物體。在進(jìn)一步的實施方 案中，如果遺傳修飾是在任何其他或相同的野生型生物體中進(jìn)行，那么任何野生型生物體 都可以被認(rèn)為是對照生物體。如果遺傳修飾是在如上文定義的核黃素高產(chǎn)生物體或菌株中 進(jìn)行，沒有本發(fā)明的遺傳修飾的所述核黃素高產(chǎn)生物體可以被認(rèn)為是對照生物體。
[0158] 如本文所述的基因修飾可導(dǎo)致由生物體生產(chǎn)或累積的核黃素量比對照生物體的 量增加。在具體的實施方案中，增加可取決于在其中進(jìn)行修飾的生物體的遺傳背景，和/或 修飾的數(shù)量，和/或降低或消除活性的技術(shù)，和/或其它因素，例如培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基條件 等，或任何上述參數(shù)和因素的組合。在具體的實施方案中，由該生物體所生產(chǎn)或積累的核黃 素的量相比不具有遺傳修飾且與所述被遺傳修飾的生物體在相同條件下培養(yǎng)的生物體，增 加可以是至少 〇· 3%、0· 5%、0· 7%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、 12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%、 90 %、100 %、110 %、120 %、130 %、140 %、150 %、160 %、170 %、180 %、190 %、200 %、210 %、 220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300% 或大于 300%。
[0159] 核黃素生產(chǎn)或累積以及因此相比于對照生物體，該生產(chǎn)在修飾的生物體中的增加 的測定可以按上述進(jìn)行，即通過基于特定的培養(yǎng)條件及使用如上文所述的基于煙酰胺的光 度測定法，遵照細(xì)胞培養(yǎng)核黃素測定方法。在具體的實施方案，測定可以按在下面提供的實 施例中的描述來執(zhí)行。本發(fā)明也設(shè)想了進(jìn)一步的測定方法或程序，包括可能在將來被開發(fā) 的方法或方法的改善。
[0160] 在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明涉及如上文定義的遺傳修飾的生物體或使用所述 遺傳修飾的生物體生產(chǎn)或累積核黃素的方法，其中所述生物體包含用RIB7啟動子替代編 碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少一種基因的天然啟動子的遺傳修飾，并且其中所述 生物體包括至少一個另外的遺傳修飾。
[0161] 如本文所用的術(shù)語"另外的遺傳修飾"指的是除了本發(fā)明的遺傳修飾外的生物體 的任何進(jìn)一步的遺傳或生化修飾，如，例如基因或基因組區(qū)域的缺失，基因或基因片段的過 表達(dá)等修飾。此另外的遺傳修飾可以已經(jīng)存在于根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的生物體中，或者可 以在對生物體進(jìn)行本發(fā)明的遺傳修飾之后引入。
[0162] 在一個優(yōu)選的實施方案中，如上所定義的生物體的另外的遺傳修飾涉及影響核黃 素生產(chǎn)的的元件。這樣的元件可能已經(jīng)是公知的，或者可能在將來被發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選地，另外的 遺傳修飾可以涉及對在假囊酵母屬，更優(yōu)選棉假囊酵母中生產(chǎn)核黃素有公知影響的活性。 已知具有這樣的影響的活性的例子，包括GLY1 ;SHM2 ;ADE4 ;PRS 2,4 ;PRS 3 ;MLS1 ;BAS1 ; RIB 1 ;RIB 2 ;RIB 3 ;RIB 4 ;RIB 5 ;RIB7 ;FAT1 ;P0X1 ;F0X2 ;P0T1/F0X3 ;GUA1 ;ADE12 ;和 頂 H)H。
[0163] 相應(yīng)地，遺傳修飾可對假囊酵母屬優(yōu)選棉假囊酵母的基因 glyl ;shm2 ;ade4 ;prs 2,4 ;prs 3 ；mlsl ；basl ；rib 1 ；rib 2 ；rib 3 ；rib 4 ;rib 5 ；rib 7 ；fatl ；poxl ；fox2 ； potl/fox3 ;gual ;adel2和/或imd3中的一個或多個進(jìn)行遺傳修飾。
[0164] 應(yīng)該理解的是，如果本發(fā)明的遺傳修飾涉及用RIB7啟動子替代天然ADE12啟動 子，那么另外的遺傳修飾不包括ADE12活性的降低或消除。類似地，如果本發(fā)明的遺傳修飾 涉及用RIB7啟動子替代天然SHM2啟動子，那么另外的遺傳修飾不包括SHM2活性的降低或 消除。此外，如果在本發(fā)明的遺傳修飾涉及用RIB7啟動子替代天然BAS1啟動子，那么另外 的遺傳修飾不包括BAS1活性的降低或消除。
[0165] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，另外的遺傳修飾可以導(dǎo)致以下改變中的至少一種： (i)GLYl活性增加；和/或（ii)SHM2活性降低或消除；和/或（iii)ADE4活性增加和/或 提供作為反饋抑制抗性的版本；和/或（iv) PRS 2,4活性增加；和/或（v) PRS 3活性增加； 和/或（vi)MLSl活性增加；和/或（vii)BASl活性降低或消除；和/或（viii)RIBl活性增 加；和/或（ix)RIB2活性增加；和/或（x)RIB3活性增加；和/或（xi)RIB4活性增加；和 /或（xii)RIB5活性增加；和/或（xiii)RIB 7活性增加；和/或（xiv)FATl活性增加；和 /或（xv)POXl活性增加；和/或（xvi)F0X2活性增加；和/或（xvii)P0Tl/F0X3活性增加； 和/或（xviii)GUAl活性增加；（xix)ADE12活性降低或消除；和/或（χχΠΜΡ?Η活性增加。
[0166] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，ADE12的活性是由包含SEQ ID N0 :9的氨基酸序列、 基本上由其組成或由其組成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID N0: 10的核苷酸序列，基本上由其組成或由其組成的核酸或其功能性部分或片段編碼，或者由 包括與SEQ ID N0:9的氨基酸序列具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上 由其組成或由其組成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括與SEQ ID N0 :10的 核苷酸序列具有至少約 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其組成或由其組成的 核酸或其功能性部分或片段編碼。
[0167] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，SHM2的活性是由包含SEQ ID N0 :11的氨基酸序列、 基本上由其組成或由其組成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID N0: 12的核苷酸序列，基本上由其組成或由其組成的核酸或其功能性部分或片段編碼，或者由 包括與SEQ ID N0:11的氨基酸序列具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上 由其組成或由其組成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括與SEQ ID N0 :12的 核苷酸序列具有至少約 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其組成或由其組成的 核酸或其功能性部分或片段編碼。
[0168] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，BAS1的活性是由包含SEQ ID N0 :13的氨基酸序列、 基本上由其組成或由其組成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID N0: 14的核苷酸序列，基本上由其組成或由其組成的核酸或其功能性部分或片段編碼，或者由 包括與SEQ ID N0:13的氨基酸序列具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或