子可以結(jié)合到SHM2、ADE12和/或BAS1并由 此誘導(dǎo)分子和蛋白質(zhì)之間的緊密的或不可逆的相互作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)或酶的正常（野 生型）功能的喪失或減少，例如，如果涉及酶的核心或結(jié)合口袋。鑒定和制備此種小分子的 方法和技術(shù)，以及檢測小分子的檢測法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且也是本文設(shè)想的。
[0213] 如果假囊酵母屬的生物體被遺傳修飾為通過獨立的復(fù)制載體減少或增加一種以 上的蛋白質(zhì)的活性，理想的是每一個載體或質(zhì)粒具有不同的篩選手段并且應(yīng)該與其他構(gòu)建 體缺乏同源性，以保持穩(wěn)定的表達并防止構(gòu)建體之間的元素重排。
[0214] 本發(fā)明還設(shè)想使用RIB7啟動子來降低在假囊酵母屬的生物體中的一個或多個基 因的表達。基因或每個基因的表達可降低至少10%、20%、30%或40%，優(yōu)選至少50%、 60 %或70 %，更優(yōu)選至少75 %、80 %、85 %或90 %，并且最優(yōu)選至少92 %、94 %或96 %。
[0215] 優(yōu)選地，通過用RIB7啟動子替代所述一個或多個基因的天然啟動子來降低表達。 術(shù)語"天然"啟動子和"RIB7啟動子"已經(jīng)如上文所定義。
[0216] 在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及使用如本文所討論的假囊酵母屬的經(jīng)遺傳修飾 的生物體來生產(chǎn)核黃素。
[0217] 生物體可以是如上文所述的任何假囊酵母屬物種，優(yōu)選棉假囊酵母。使用假囊酵 母屬來增加核黃素的累積可以包括使用適宜的發(fā)酵環(huán)境，營養(yǎng)，自發(fā)酵容器的核黃素提取 等。本發(fā)明因此設(shè)想了相應(yīng)的生產(chǎn)核黃素，或其如上文所定義的衍生物的方法。在具體的 實施方案中，作為用于本發(fā)明遺傳修飾的起始生物體的假囊酵母屬物種是每升培養(yǎng)基能夠 累積50-100mg核黃素，更優(yōu)選超過每升培養(yǎng)基50-100mg核黃素的生物體。在進一步的實 施方案中，假囊酵母屬物種可以是已被遺傳修飾的生物體。遺傳修飾可以是如本文所述的 修飾，例如對核黃素的生產(chǎn)或累積有直接的影響，或者可以具有不同的效果，例如在其它途 徑中，或關(guān)注于生產(chǎn)除了核黃素以外的其它生化實體如PUFA、脂肪酸、氨基酸、糖等，關(guān)注于 使用某些碳源的可能性，關(guān)注于使用某些氮源等的可能性，關(guān)注于基因組或基因組區(qū)域的 穩(wěn)定性，允許或改善同源重組的步驟，允許異源基因或啟動子等的表達，提高細(xì)胞培養(yǎng)行為 如成絲，菌絲體片段化，pH耐受性，密度耐受性，鹽的使用，鹽耐受性，關(guān)注于細(xì)胞的生產(chǎn)速 率，關(guān)注于對抗生素的抗性或其他任何可能對核黃素生產(chǎn)或核黃素和其他產(chǎn)品共生產(chǎn)有利 的性狀。
[0218] 在進一步的方面，本發(fā)明涉及使用如上文定義的用于核黃素生產(chǎn)的生物體，特別 是被遺傳修飾的生物體，包括上述用RIB7啟動子替代編碼負(fù)面調(diào)控核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì) 的基因的天然啟動子的遺傳修飾，以及任選地其他的遺傳修飾，例如，如上文所定義的基因 glyl；shm2 ；ade4 ；prs 2,4 ;prs 3 ；mlsl ；basl ；rib 1 ；rib 2 ；rib 3 ；rib 4 ;rib 5 ；fatl ； poxl ;fox2 ;potl/fox3 ;adel2 ;gual ;imd3 ;和 / 或 rib7 的修飾。
[0219] 來自如上文定義的至少一種生物體的核黃素產(chǎn)品可以是為符合其用途而已被修 飾和調(diào)整的制品。這樣的制品可以包括適合作為動物飼料或作為人類食品產(chǎn)品，作為膳食 補充劑或藥物制劑，真菌片劑，嬰兒和兒童食品廣品等的可食用制品。核黃素制品可進一步 包括用于工業(yè)化生產(chǎn)的核黃素。進一步設(shè)想用于化學(xué)合成工藝，藥理用途等的核黃素制品。
[0220] 以下實施例和附圖是用于說明的目的。因此可以理解，所述實施例和附圖不應(yīng)被 解釋為限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯然能夠設(shè)想本文中提出的原則的進一步的變形。
[0221] 實施例1
[0222] RIB7基因表達的表征及在棉假囊酵母中相應(yīng)的RIB7啟動子
[0223] 在棉假囊酵母中負(fù)責(zé)正確的核黃素生產(chǎn)的所有RIB基因（RIB1、RIB2、RIB3、RIB4、 RIB5、RIB7)的轉(zhuǎn)錄分析表明，RIB7基因在野生型菌株ATCC 10895中呈現(xiàn)出非常低的mRNA 水平。定量實時PCR(qRT-PCR)分析表明RIB7的轉(zhuǎn)錄率比GPD基因低約200倍（圖2)。因 此，RIB7啟動子可以是用作在棉假囊酵母中靶向降低基因表達的工具。
[0224] 因此，鑒定了 RIB7基因的啟動子序列（RIB7p)，其中包括核苷酸-1到_102(SEQ ID No. 1)，并將其克隆到質(zhì)粒JR3573 (SEQ ID No. 2)，該質(zhì)?？杀挥米鳟a(chǎn)生所有低表達構(gòu)建體 的模板。該質(zhì)粒含有融合到kanMX4標(biāo)記的3'端的RIB7啟動子序列。標(biāo)記盒還包含兩個 lox序列，其使抗性標(biāo)記基因在CRE介導(dǎo)的重組后有效的回收（Guldener等人（1996)Nucl. Acids Res. 24 :2519-2524)。
[0225] 實施例2
[0226] 使用RIB7啟動子特異降低在棉假囊酵母中的基因表達的構(gòu)建體的產(chǎn)生
[0227] 對于ADE12基因表達的靶向降低，將天然的ADE12基因放在上面描述的棉假囊酵 母的弱RIB7啟動子（RIB7p)的控制下。
[0228] 為設(shè)計相應(yīng)的低表達盒，將質(zhì)粒JR3573用作PCR模板，用寡核苷酸 loxPK-RIB7p-ADE12-ins5(SEQ ID Νο·3)和 loxPK-RIB7p-ADE12-ins3(SEQ ID Νο·4)提供 在基因組的正確位點用于整合PCR擴增子的同源重組端（homA及homB)。在這種情況下， 5'重組序列被設(shè)計為替代天然ADE12啟動子序列的核苷酸-1至-50。將所得的1962bp的 PCR擴增子（圖3a，SEQ ID No. 5)純化并用于棉假囊酵母屬株ATCC 10895的轉(zhuǎn)化。
[0229] 為了進一步支持RIB7啟動子是適合用于特異降低基因表達的工具這一理論，將 強轉(zhuǎn)錄的RIB1基因放在這種弱啟動子的控制之下。RIB1基因編碼核黃素生物合成酶，該酶 催化合成的限速步驟。因此，特異降低基因表達應(yīng)該導(dǎo)致較低的酶活性，從而導(dǎo)致明顯降低 但不完全抑制的核黃素合成。
[0230] 為設(shè)計相應(yīng)的低表達盒，將質(zhì)粒JR3573用作PCR模板，用寡核苷酸 RIB7p-RIBl-ins5(SEQ ID Νο·6)和 RIB7p-RIBl-ins3(SEQ ID Νο·7)提供在基因組的正確 位點用于整合PCR擴增子的同源重組端（homA及homB)。在這種情況下，5'重組序列被設(shè) 計為替代天然RIB1啟動子序列的核苷酸-1至-42。將所得的1962bp的PCR擴增子（圖 3b，SEQ ID No. 8)純化并用于棉假囊酵母屬株ATCC 10895的轉(zhuǎn)化。通過分析PCR和DNA測 序來確認(rèn)低表達模決的正確的基因組整合以及相應(yīng)的啟動子替代（還參見實施例3)。
[0231] 實施例3
[0232] 基于使用RIB7啟動子的攜帶低表達構(gòu)建體的棉假囊酵母屬株的產(chǎn)生和分子分析
[0233] 如上所述（參見實施例2)生成攜帶在弱棉假囊酵母RIB7啟動子控制下的相 應(yīng)基因的ADE12和RIB1下調(diào)構(gòu)建體。使用棉假囊酵母屬株ATCC 10895的孢子，按照 SchlUpen 等人（2003)Biochem. J. 369 :263_273and Jimenez 等人（2005) Appl. Environm. Microbiol. 71 :5743-5751提供的方案轉(zhuǎn)化經(jīng)純化的片段。將所得的轉(zhuǎn)化體在28°C生長并 在含有250 yg/mL遺傳霉素（G418, Sigma Aldrich)的MA2培養(yǎng)基（10g/L細(xì)菌用蛋白胨， l〇g/L葡萄糖，lg/L酵母提取物，0. 3g/L Myoinosit，20g/L瓊脂）中篩選。
[0234] 隨后，使用 DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen，Germany)，根據(jù)制造商的推薦，分離 每一轉(zhuǎn)化體的基因組DNA。然后將基因組DNA用于不同的PCR分析，檢測在5'-和3'-整 合位點處的正確的啟動子替代。此外，對所有擴增子進行DNA測序以驗證正確的整合事件。
[0235] 針對單孢子分離選擇陽性轉(zhuǎn)化體以確保獲得同核型菌株。單孢子分離如下：在將 轉(zhuǎn)化體的菌絲體溶解于500 μ L鹽水-Triton溶液（9g/L NaCl，600 μ L/L Triton X-100) 后，加入500 μ L正己燒并混合。將混合物在14000rpm離心lmin，并且將包含于上層相中 的單孢子于含有250 μ g/mL遺傳霉素（G418)的SP培養(yǎng)基平板（3g/L大豆粉，3g/L酵母提 取物，3g/L麥芽提取物，20g/L玉米面，lg/L消泡劑，10g/L葡萄糖，30g/L瓊脂，pH6. 8)上鋪 板。
[0236] 再次如上所述用PCR分析來測試從單孢子分離得到的菌株。陽性菌株用于CRE重 組以消除 KanMX 選擇標(biāo)記。按照 Guldener 等人（1996)Nucl. Acids Res. 24 :2519-2524 所 述進行用于CRE重組的轉(zhuǎn)化。所得的菌株進行PCR分析以確認(rèn)選擇標(biāo)記刪除事件。選擇已 顯示出刪除了選擇標(biāo)記并且同時正確整合相應(yīng)的低表達模決的菌株，用于ADE12和RIB1的 mRNA水平的qRT-PCR分析，并與野生型菌株ATCC 10895的ADE12和RIB1的mRNA水平比 較。此外，將這些菌株在搖瓶實驗中生長以測試核黃素生產(chǎn)，并測定與參照棉假囊酵母屬株 ATCC 10895相比的相應(yīng)產(chǎn)率（參見實施例4)。
[0237] 實施例4
[0238] 攜帶基于使用RIB7啟動子的低表達構(gòu)建體的棉假囊酵母屬株的mRNA水平分析和 相應(yīng)的核黃素生產(chǎn)
[0239] 進行ADE12以及RIB1基因表達的下調(diào)以顯示RIB7啟動子在棉假囊酵母中特異性 下調(diào)基因表達的適用性，因此，產(chǎn)生具有期望特性（例如在ADE12的情況下，原養(yǎng)型和更高 的核黃素生產(chǎn)）的菌株。通過qRT-PCR實驗分析RIB7啟動子的適用性，以顯示特異性下調(diào) 基因表達。此外，在搖瓶實驗中測試上述菌株，并且測定核黃素滴度。作為參照，在所有實 驗并行地分析親本菌株ATCC 10895。
[0240] 用 LightCycler 480 實時 PCR 儀（Roche，德國），使用 SYBR green I master mix (Roche，德國）并按照制造商的說明進行qRT-PCR。如先前所述（Mateos等人（2006) Appl.Environm. Microbiol. 72 :5052-5060)獲得總 RNA 樣品，使用 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche，德國）制備 cDNA 樣品并且選擇 RIB1 和 ADE12 基因的 特異性引物序列。所有的實時PCR反應(yīng)都一式兩份進行并且有至少兩個獨立的實驗。使用 LightCycler 480軟件進行定量分析。
[0241] 使用分光光度法測定法來測量總（細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的）核黃素生產(chǎn)水平。在28°C， 150rpm下，在MA2培養(yǎng)基中以回轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)用于核黃素分析的菌株。向lmL培養(yǎng)物中加入 1M體積的HC1并在100°C培養(yǎng)30min。冷卻樣品后，用0. 5mm玻璃珠（Sigma-Aldrich)和劇 烈禍流來裂解菌絲體。離心后，在Varioskan微量滴定板讀數(shù)器（Thermo Scientific)上 通過分光光度（λ exc = 450nm)來測定上清液中的核黃素（含有細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)核黃素） 濃度。校準(zhǔn)曲線是用純的核黃素（Sigma-Aldrich)進行，并以與樣本相同的方式處理。
[0242] 如圖4所示的qRT-PCR結(jié)果表明在攜帶RIB7p-ADE12構(gòu)建體的菌株中的ADE12基 因的mRNA水平極度降低。ADE12基因表達比攜帶在天然啟動子控制下的ADE12基因的野生 型菌株中低約70倍。然而，這些轉(zhuǎn)錄水平足以維持沒有腺嘌呤補充的突變體的生長。
[0243] 通過使用RIB7啟動子下調(diào)RIB1基因獲得類似的結(jié)果。在這種情況下，RIB1基因 表達比在野生型ATCC 10895中降低了 3倍。這些結(jié)果表明，RIB7啟動子的確是適合用于 在棉假囊酵母中靶向下調(diào)基因表達的工具。
[0244] 為了說明使用RIB7啟動子下調(diào)特異性基因表達可用作靶向修飾核黃素生產(chǎn)的工 具，分析攜帶ADE12和RIB1表達不足的構(gòu)建體的菌株中的核黃素合成。如圖5所示，在孵 育7天后，攜帶在棉假囊酵母的弱RIB7啟動子控制下的ADE12基因的菌株ATCC 10895 :: RIB7p-ADE12顯示出比野生型菌株ATCC 10895的核黃素生產(chǎn)增加超過2倍。正如預(yù)期的， 攜帶RIB7p-RIBl構(gòu)建體的菌株ATCC 10895顯示出核黃素生產(chǎn)的顯著降低（約3倍的降 低）。因此，替換RIB1天然啟動子導(dǎo)致酶活性降低從而明顯降低核黃素生物合成。
[0245] 這兩個例子表明，通過使用RIB7啟動子特異性下調(diào)基因表達可以有助于產(chǎn)生具 有用于工業(yè)發(fā)酵過程所需特性的棉假囊酵母屬株。因此，RIB7啟動子是適合用于棉假囊酵 母菌株的代謝工程的新的工具。
【主權(quán)項】
1. 一種在假囊酵母屬的生物體中生產(chǎn)核黃素的方法，所述生物體被遺傳修飾為用 RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少一個基因的天然啟動子，所述方 法包括： (i) 在合適的培養(yǎng)基中生長所述被遺傳修飾的生物體；和 (ii) 從培養(yǎng)基分尚核黃素。2. -種假囊酵母屬的累積核黃素的生物體，其被遺傳修飾為用RIB7啟動子替代編碼 負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少一個基因的天然啟動子。3. 權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求2的生物體，其中與沒有遺傳修飾且與所述被遺傳修 飾的生物體在相同的條件下培養(yǎng)的生物體相比，所述被遺傳修飾的生物體能夠累積更多的 核黃素。4. 權(quán)利要求1或3的方法，或權(quán)利要求2或3的生物體，其中所述負(fù)面影響核黃素生產(chǎn) 的基因選自adel2、shm2和basl組成的組。5. 權(quán)利要求4的方法或生物體，其中ade 12基因的編碼序列選自下組： (a) 根據(jù)SEQ ID No. 10的核酸序列或其功能性部分； (b) 編碼根據(jù)SEQ ID No. 9的多肽的核酸序列或其功能性部分；和 (c) 與根據(jù)SEQ ID No. 10的核酸序列具有至少70%的序列同一性的核酸序列；和/或 shm2基因的編碼序列選自下組： (a) 根據(jù)SEQ ID No. 12的核酸序列或其功能性部分； (b) 編碼根據(jù)SEQ ID No. 11的多肽的核酸序列或其功能性部分；和 (c) 與根據(jù)SEQ ID No. 12的核酸序列具有至少70%的序列同一性的核酸序列；和/或 basl基因的編碼序列選自下組： (a) 根據(jù)SEQ ID No. 14的核酸序列或其功能性部分； (b) 編碼根據(jù)SEQ ID No. 13的多肽的核酸序列或其功能性部分；和 (c) 與根據(jù)SEQ ID No. 14的核酸序列具有至少70%的序列同一性的核酸序列。6. 權(quán)利要求1或3至5中任一項的方法或權(quán)利要求2至5中任一項的生物體，其中 RIB7啟動子包括選自下組的核酸序列： (a) 包括根據(jù)SEQ ID No. 1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和 (b) 與根據(jù)SEQ ID No. 1的核酸序列具有至少70%的序列同一性的核酸序列或其功能 性部分。7. 權(quán)利要求1或3至6中任一項的方法或權(quán)利要求2至6中任一項的生物體，其中所 述生物體包括至少一個另外的遺傳修飾。8. 權(quán)利要求7的方法或生物體，其中所述另外的遺傳修飾導(dǎo)致選自下組的至少一種活 性的改變：9.權(quán)利要求7或8的方法或生物體，其中所述另外的遺傳修飾導(dǎo)致以下改變中的至少 一種： (i) GLYl活性增加；和/或 (ii) SHM2活性降低或消除；和/或 (iii) ADE4活性增加和/或提供作為反饋抑制抗性的版本；和/或 (iv) PRS 2,4活性增加；和/或 (v) PRS 3活性增加；和/或 (vi) MLSl活性增加；和/或 (vii) BASl活性降低或消除；和/或 (viii) RIB 1活性增加；和/或 (ix) RIB 2活性增加；和/或 (X) RIB 3活性增加；和/或 (xi) RIB 4活性增加；和/或 (xii) RIB 5活性增加；和/或 (xiii) RIB 7活性增加；和/或 (xiv) FATl活性增加；和/或； (xv) POXl活性增加；和/或； (xvi) F0X2活性增加；和/或； (xvii) P0Tl/F0X3活性增加；和/或； (xviii) GUAl活性增加；和/或； (xix) ADE12活性降低或消除；和/或 (xxHMPDH活性增加。 10. RIB7啟動子在降低假囊酵母屬的生物體中的至少一種基因的表達中的用途。11. 權(quán)利要求10的用途，其中RIB7啟動子包括選自以下組的核酸序列： (a) 包括根據(jù)SEQ ID No. 1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和 (b) 與根據(jù)SEQ ID No. 1的核酸序列具有至少70%的序列同一性的核酸序列或其功能 性部分。12. 權(quán)利要求10或11的用途，其中所述基因選自adel2、shm2和basl組成的組。13. 權(quán)利要求10至12中任一項的用途，其中所述表達通過用RIB7啟動子替代基因的 天然啟動子而被降低。14. 權(quán)利要求2至9中任一項所限定的生物體在生產(chǎn)核黃素中的用途。15. 權(quán)利要求1或3至9中任一項的方法，權(quán)利要求2至9中任一項的生物體， 或者權(quán)利要求10至14中任一項的用途，其中所述假囊酵母屬的生物體是物種阿舒假 囊酉孝母（Eremothecium ashbyi)，棒針抱酉孝母（Eremothecium coryli)，Eremothecium cymbalariae，棉假囊酉孝母（Eremothecium gossypii)，Eremothecium sinecaudum或假囊酉孝 母屬物種CID1339。
【專利摘要】本發(fā)明涉及在生物體中生產(chǎn)核黃素的方法，所述生物體被遺傳修飾為用RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少一個基因的天然啟動子，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中生長所述生物體和從培養(yǎng)基分離核黃素。本發(fā)明還涉及屬于假囊酵母屬的被遺傳修飾的生物體，以及這種遺傳修飾的生物體在提高核黃素的累積中的用途。
【IPC分類】C12N1/19, C12P25/00, C12N15/113, C12N15/63, C12R1/645
【公開號】CN105603034
【申請?zhí)枴緾N201510784747
【發(fā)明人】B·霍夫, A·莫爾特, S·哈夫納, O·策爾德爾, 多瓦爾 J·L·雷韋爾塔, R·萊德斯馬-阿馬羅, 布埃 R·馬丁內(nèi)斯, 加西亞 A·希門尼斯
【申請人】巴斯夫歐洲公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年11月16日