一種多種淋巴細(xì)胞亞群的擴(kuò)增方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種高效同時(shí)擴(kuò)增多種淋巴細(xì) 胞亞群的方法及制備得到的細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 過(guò)繼性免疫治療是一種近期在治療實(shí)體瘤和血液癌癥臨床試驗(yàn)中取得良好效果 的治療方法，并且成為了發(fā)展迅速的醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。過(guò)繼性免疫治療的方法包括分離免疫 細(xì)胞，離體細(xì)胞擴(kuò)增，及擴(kuò)增后的免疫細(xì)胞回輸入癌癥患者。過(guò)繼性免疫療法成功根除癌癥 的例子包括應(yīng)用腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)、T細(xì)胞受體(TCR)修飾的T細(xì)胞和嵌合抗原受體 (CAR)修飾的Τ細(xì)胞。這些免疫細(xì)胞主要為αβΤ細(xì)胞。表達(dá)α和β鏈組成Τ細(xì)胞受體。除了αβΤ細(xì) 胞外，許多其他類(lèi)型的免疫細(xì)胞，例如細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷(CIK)細(xì)胞、CD3CD56雙陽(yáng)性ΝΚΤ細(xì) 胞、CD3陰性CD56陽(yáng)性的ΝΚ細(xì)胞和γ δΤ淋巴細(xì)胞，也可用于癌癥的過(guò)繼免疫治療。
[0003] 上述細(xì)胞中，CIK細(xì)胞是一種體外用IFN γ、IL-2和抗⑶3抗體刺激3至4周生成的淋 巴細(xì)胞，是一種新型的免疫活性細(xì)胞。首先加入IFNy是CIK細(xì)胞擴(kuò)增的關(guān)鍵一步，IFNy可 活化存在于PBMC中的單核細(xì)胞，提供接觸依賴性因子⑶58/LFA-3和IL-12，這些因子有利于 獲得的最終生成的淋巴細(xì)胞的Thl細(xì)胞表型和CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒力。IFN-γ可直接抑制Th2 細(xì)胞的增殖，從而抑制CD4+細(xì)胞的生成，有利于CD8+和TH1細(xì)胞的生成。抗CD3抗體，如0KT3， 提供一個(gè)初始的有絲分裂信號(hào)，然后由IL-2作為一種強(qiáng)有力的T細(xì)胞有絲分裂原持續(xù)刺激T 細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，在3至4周的刺激后，免疫細(xì)胞總數(shù)可擴(kuò)增數(shù)百倍，甚至上千倍。
[0004] 擴(kuò)增后產(chǎn)生的CIK細(xì)胞含有多種淋巴細(xì)胞亞群。大部分為⑶3+⑶4+T淋巴細(xì)胞和 ⑶3+⑶8+T淋巴細(xì)胞。雖然⑶3+⑶56+NKT淋巴細(xì)胞和⑶3-/⑶56+NK細(xì)胞只占一小部分，這些 免疫細(xì)胞，特別是NKT細(xì)胞，具有直接的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。這些細(xì)胞表達(dá)天然殺傷細(xì)胞受 體NKG2D(CD314)，可以非MHC限制性的方式溶解腫瘤細(xì)胞，用CIK細(xì)胞進(jìn)行臨床實(shí)體瘤過(guò)繼 免疫治療呈現(xiàn)了很高的安全性。
[0005] 絕大多數(shù)T淋巴細(xì)胞屬于αβΤ細(xì)胞，它們的T細(xì)胞受體由α和β鏈組成，一小部分T淋 巴細(xì)胞表達(dá)Τ細(xì)胞受體gamma和delta異二聚體（γ δ)鏈。αβΤ細(xì)胞的激活需要通過(guò)抗原加工 和抗原提呈細(xì)胞呈現(xiàn)的MHC限制肽。與αβΤ細(xì)胞不同，γ δΤ細(xì)胞通過(guò)γ δΤΟ?直接識(shí)別腫瘤抗 原，對(duì)微生物病原體和腫瘤具有強(qiáng)大的非MHC-限制性溶解活性，所以γ δΤ細(xì)胞在腫瘤和感 染的免疫監(jiān)視方面起到重要作用。在人體血液中，γ ST細(xì)胞占 Τ淋巴細(xì)胞總數(shù)的2-10%，為 了有足夠量的γ st細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼細(xì)胞免疫治療，病人往往需要經(jīng)過(guò)大容量白細(xì)胞單采術(shù)來(lái) 收集大量外周血單核細(xì)胞，單采術(shù)技術(shù)可收集1 X 1〇~9個(gè)外周血單核細(xì)胞，生產(chǎn)幾十億的γ ST細(xì)胞用于多次注射，ΙΡΡ(異戊烯焦磷酸)是人類(lèi)γ δΤ細(xì)胞的天然抗原，已用于γ δΤ細(xì)胞的 擴(kuò)增，異戊烯焦磷酸的合成類(lèi)似物溴醇焦磷酸(BrHPP)及雙膦酸鹽唑來(lái)膦酸(Zometa)也可 以選擇性地激活擴(kuò)增γ δΤ細(xì)胞。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中，臨床試驗(yàn)廣泛采用單獨(dú)使用某一種免疫細(xì)胞成分進(jìn)行癌癥治療，多 種免疫細(xì)胞亞群同時(shí)應(yīng)用一起攻擊一個(gè)腫瘤中的不同的目標(biāo)的方式在臨床上還沒(méi)有得到 很好地探索。理論上，同時(shí)使用多種免疫細(xì)胞亞群的方法能通過(guò)攻擊多個(gè)不同的腫瘤目標(biāo) 擴(kuò)大免疫反應(yīng)的范圍，可能會(huì)提供癌癥治療的協(xié)同作用。在這個(gè)方面，廣泛研究已證實(shí)γδτ 細(xì)胞對(duì)多種免疫反應(yīng)的獨(dú)特和重要的貢獻(xiàn)。γ st細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞之間的相互作用已經(jīng) 被證實(shí)在這些免疫反應(yīng)中發(fā)揮核心作用。
[0007] 在臨床應(yīng)用上，腫瘤過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療可能需要高達(dá)10~11免疫細(xì)胞，所以開(kāi)發(fā) 有效的大規(guī)模的免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法是過(guò)繼性免疫治療成功的一個(gè)關(guān)鍵。一種稱作"快速 擴(kuò)增程序(REP)〃的方法已用于αβτ細(xì)胞的體外大量擴(kuò)增?？焖贁U(kuò)增程序是一種非特異性(抗 原非依賴性）的免疫細(xì)胞擴(kuò)增方案，該方案采用過(guò)量的致死劑量伽瑪輻照異體外周血單個(gè) 核細(xì)胞（PBMC)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，同時(shí)使用抗CD3抗體（0ΚΤ3)和外源重組人白細(xì)胞介素 (rhIL)-2。這種快速擴(kuò)增程序可以致使Τ淋巴細(xì)胞在14天內(nèi)擴(kuò)增1000倍。
[0008] 雖然上述快速擴(kuò)增程序是一種常用的方法，但它的應(yīng)用受到材料和技術(shù)上的限 制。在臨床應(yīng)用快速擴(kuò)增程序時(shí)，一個(gè)T細(xì)胞中通常會(huì)用200個(gè)外周血單核細(xì)胞來(lái)刺激。所以 快速擴(kuò)增程序需要用血細(xì)胞分離機(jī)大容量白細(xì)胞單采術(shù)從多個(gè)健康的捐助者收集大量異 體外周血單核細(xì)胞。快速擴(kuò)增方案中所收集的外周血單核細(xì)胞來(lái)自異體，需要經(jīng)過(guò)大量的 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，以確認(rèn)處于無(wú)菌狀態(tài)，這可能既昂貴又費(fèi)時(shí)。并且，由于外周血單核細(xì)胞來(lái)自 于多個(gè)捐助者，收集而來(lái)的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞擴(kuò)增的維持作用在捐助者個(gè)體間可 能會(huì)表現(xiàn)出很大的差異性，所有這些問(wèn)題都會(huì)對(duì)大型多中心隨機(jī)臨床試驗(yàn)有所妨礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于現(xiàn)有，現(xiàn)有擴(kuò)增免疫細(xì)胞的方法昂貴費(fèi)時(shí)、 且外周血單核細(xì)胞來(lái)自于多個(gè)捐助者，對(duì)T細(xì)胞的維持作用差異性較大，從而提出一種體外 刺激外周血高效同時(shí)擴(kuò)增多種淋巴細(xì)胞亞群的方法及制備得到的細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒。
[0010] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0011] 本發(fā)明提供一種多種淋巴細(xì)胞亞群的擴(kuò)增方法，其包括如下步驟：
[0012] S1、在腫瘤病人血液中收集的PBMC的培養(yǎng)基中加入IFNy和唑來(lái)膦酸，培養(yǎng)后再加 入0KT3抗體和重組人白細(xì)胞介素-2，刺激所述PBMC，完成淋巴免疫細(xì)胞初步擴(kuò)增;所述腫瘤 包括血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤細(xì)胞。S2、初步擴(kuò)增完成后，淋巴免疫細(xì)胞與飼養(yǎng)層細(xì)胞混合， 并加入唑來(lái)膦酸、0KT3抗體和重組人白細(xì)胞介素-2后繼續(xù)擴(kuò)增。
[0013] 作為優(yōu)選，所述飼養(yǎng)層細(xì)胞為正常人PBMC、人類(lèi)紅白血病細(xì)胞株K562或人成纖維 細(xì)胞中的一種，所述飼養(yǎng)層細(xì)胞與淋巴免疫細(xì)胞的混合比例為1:1-300:1。
[0014] 作為優(yōu)選，所述飼養(yǎng)層細(xì)胞與淋巴免疫細(xì)胞的混合比例為50:1-200:1。
[0015] 作為優(yōu)選，所述步驟S1中所述培養(yǎng)基中同時(shí)加入IL-15和IL-18。
[0016]作為優(yōu)選，所述正常人PBMC、所述人類(lèi)紅白血病細(xì)胞株K562和所述人成纖維細(xì)胞 在使用前經(jīng)100G的γ輻照或使用絲裂霉素 C處理。
[0017] 作為優(yōu)選，所述人類(lèi)紅白血病細(xì)胞株Κ562細(xì)胞為經(jīng)過(guò)基因工程改造過(guò)的人類(lèi)紅白 血病細(xì)胞株Κ562細(xì)胞，所述基因工程改造過(guò)的人類(lèi)紅白血病細(xì)胞株Κ562細(xì)胞為經(jīng)過(guò)遺傳修 飾的Κ562細(xì)胞，其可穩(wěn)定表達(dá)⑶64高親和力Fc受體基因，共刺激分子⑶86和分子⑶137L基 因。
[0018]作為優(yōu)選，所述正常人PBMC是從身體健康，無(wú)腫瘤病史的捐獻(xiàn)者的血液中收集的； 所述人成纖維細(xì)胞為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成的人成纖維樣細(xì)胞。
[0019] 作為優(yōu)選，所述步驟S1中，所述IFNy濃度為500-1500IU/ml，所述唑來(lái)膦酸濃度為 2-10μΜ，所述0KT3抗體濃度為20-100ng/ml，所述重組人白細(xì)胞介素-2的濃度為100-600IU/ mL〇
[0020] 作為優(yōu)選，所述IL-15的濃度為10ng/ml，所述IL-18的濃度為10ng/ml。
[0021] 本發(fā)明還提供了所述的多種淋巴細(xì)胞亞群的擴(kuò)增方法在癌癥的過(guò)繼性免疫治療 中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] (1)本法明提供的多種淋巴細(xì)胞亞群的擴(kuò)增方法，初步擴(kuò)增完成后，免疫細(xì)胞總數(shù) 在這段時(shí)間可擴(kuò)增約10到40倍，其中γ δτ細(xì)胞擴(kuò)增可達(dá)600倍，⑶3⑶56雙陽(yáng)性NKT細(xì)胞擴(kuò)增 約200倍，通常50%擴(kuò)增后的細(xì)胞為γδΤ細(xì)胞，