后的免 疫細胞與血癌細胞以指定的效應(yīng)/目標(biāo)(E to T)比率進行共培養(yǎng)，共同孵育3個小時后進行 德爾菲亞(DELFIA)細胞毒性分析測定，測定使用DELFIAEuTDA細胞試劑盒:先用熒光增強配 體(BATDA)溶液在37°C中標(biāo)記靶細胞15分鐘，大量清洗后，重新懸浮細胞團塊，調(diào)整細胞密 度到5x E4細胞/毫升并與效應(yīng)免疫細胞混合，將準(zhǔn)備好的效應(yīng)和靶細胞接種到96U形底孔 板中，效應(yīng)細胞與靶細胞(E:T)的使用比率范圍從40:1到1: 1，設(shè)置為對照組(僅添加了靶細 胞）、實驗組(靶細胞加入10微升裂解緩沖液)和空白組(沒有添加細胞），經(jīng)過37°C共同孵化 2~3小時后，將培養(yǎng)板離心后，將20微升上清小心地轉(zhuǎn)入平底板中并加入200微升銪溶液， 在使用Vict 〇r3讀取數(shù)值前，把混合溶液放于室溫下振蕩15分鐘，并使用下面的公式計算殺 傷率：％特異性釋放=[實驗釋放(計數(shù)）一自發(fā)釋放(計數(shù)）]/[最大釋放(計數(shù)）一自發(fā)釋放 (計數(shù)）]X 100，所述靶細胞采用K562人類髓系白血病細胞株和DaudiBurkitt ' s淋巴瘤細 胞，細胞共培3小時后測量腫瘤癌細胞溶解活性，結(jié)果和所用的效應(yīng)細胞和靶細胞比例如圖 21-22所示:使用所述方法擴增得到的免疫細胞能夠直接裂解人類髓系白血病細胞株K562 細胞和Daudi Burkitt's淋巴瘤細胞。
[0075] 3.擴增后免疫細胞用于CAR免疫治療：
[0076] CAR治療技術(shù)的本質(zhì)是基因治療，作用原理是利用基因工程技術(shù)，修飾免疫細胞使 其表達嵌合性抗原受體(CAR)以識別腫瘤表面特異性分子。用于制備CAR免疫細胞的CAR基 因包括細胞外腫瘤分子識別域，細胞膜間隔域，和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，精心設(shè)計的CAR T細胞能憑借其靶向性優(yōu)勢有效的特異性的殺傷癌癥細胞。
[0077] 首先，構(gòu)建一種⑶19特異性RNA CAR，CAR構(gòu)建時首先人工合成一個DNA片段含有的 序列編碼包括抗⑶19的單鏈抗體片段(FMC63scFv)、⑶8跨膜結(jié)構(gòu)域，共刺激域⑶27和⑶3ζ 結(jié)構(gòu)域，如表3所示。
[0078] DNA片段兩端聯(lián)有兩個消化位點的SphI和Sal I。消化酶處理后，此DNA片段插入 pFastBac質(zhì)粒。CAR的表達用CMV和T7啟動子控制。為了提高mRNA細胞轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定性，對 CAR兩側(cè)與β珠蛋白5 ' UTR及3 ' UTR聯(lián)接。在體外mRNA合成前，采用PCR準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄的模板，一對 PCR引物從CMV啟動子開始至β珠蛋白3'UTR的末端，下游PCR引物含有合成的120NT，可用于 制備多聚腺苷酸(polyA)，mRNA合成使用Invitrogen的mMessage mMachine T7試劑盒。
[0079]表 3 「00801
[00811然后檢測了是否能用這種RNA CAR修飾以上使用K562飼養(yǎng)層細胞擴增的免疫細 胞，從而改善它們對CD19陽性的癌細胞的細胞毒性作用，采用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染擴增后的免 疫細胞，使用1^??1?^041?電穿孔評估轉(zhuǎn)染效率時，約80%的免疫細胞轉(zhuǎn)染成功，1^??1^八 CAR是⑶19特異性RNA CAR的一種對照載體，構(gòu)建時以GFP取代⑶19單鏈變量片段(scFv)，所 以無法識別表達⑶19陽性的癌細胞。當(dāng)⑶19陽性人EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細胞系LCL、Daud i Burkitt's淋巴瘤細胞及Raji Burkitt淋巴瘤細胞與⑶19特異性RNA CAR移植的免疫細胞 共培養(yǎng)時，酶聯(lián)免疫斑點法檢測發(fā)現(xiàn)CD19特異性RNA CAR移植大大增強了免疫細胞的細胞 毒性，如圖23-24所示。德爾菲亞(DELFIA)
[0082] 細胞毒性進一步證實了增強的細胞毒性，在E:T比率為20:1時⑶19特異性RNA CAR 移植的免疫細胞能夠100%殺死Raji腫瘤癌細胞，mGFP CAR移植的對照免疫細胞殺死少于 80 %的Raj ixb，如圖25所示。
[0083]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或 變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【主權(quán)項】
1. 一種多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，包括如下步驟： S1、在腫瘤病人血液中收集的PBMC的培養(yǎng)基中加入IFNy和唑來膦酸，培養(yǎng)后再加入 0KT3抗體和重組人白細胞介素-2，刺激所述PBMC，完成淋巴免疫細胞初步擴增;所述腫瘤包 括血液系統(tǒng)腫瘤和實體瘤細胞。S2、初步擴增完成后，淋巴免疫細胞與飼養(yǎng)層細胞混合，并 加入唑來膦酸、0KT3抗體和重組人白細胞介素-2后繼續(xù)擴增。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)層細胞 為正常人PBMC、人類紅白血病細胞株K562或人成纖維細胞中的一種，所述飼養(yǎng)層細胞與淋 巴免疫細胞的混合比例為1:1-300:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)層細胞 與淋巴免疫細胞的混合比例為50:1-200:1。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，所述步 驟S1中所述培養(yǎng)基中同時加入IL-15和IL-18。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，所述正常人 PBMC、所述人類紅白血病細胞株K562和所述人成纖維細胞在使用前經(jīng)100G的γ輻照或使用 絲裂霉素 C處理。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，所述人類紅白血 病細胞株Κ562細胞為經(jīng)過基因工程改造過的人類紅白血病細胞株Κ562細胞，所述基因工程 改造過的人類紅白血病細胞株Κ562細胞為經(jīng)過遺傳修飾的Κ52細胞，其可穩(wěn)定表達CD64高 親和力Fc受體基因，共刺激分子⑶86和分子⑶137L基因。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，所述正常人PBMC 是從身體健康，無腫瘤病史的捐獻者的血液中收集的；所述人成纖維細胞為人誘導(dǎo)多能干 細胞分化成的人成纖維樣細胞。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，所述步 驟31中，所述正~丫濃度為500-150011]/1111，所述唑來膦酸濃度為2-1(^1，所述01〇'3抗體濃度 為20-100ng/ml，所述重組人白細胞介素-2的濃度為100-600IU/mL。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其特征在于，所述IL-15的濃 度為10ng/ml，所述IL-18的濃度為10ng/ml。10. 權(quán)利要求1-9任一項所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法在制備癌癥的過繼性免 疫治療藥物中的應(yīng)用。11. 如權(quán)利要求1 〇所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法在制備CD 19特異性RNA CAR細 胞免疫藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多種淋巴細胞亞群的擴增方法及其在制備癌癥的過繼性免疫治療藥物中的應(yīng)用，擴增方法包括，S1、在腫瘤病人血液中收集的PBMC的培養(yǎng)基中加入IFNγ和唑來膦酸，培養(yǎng)后再加入OKT3抗體和重組人白細胞介素-2，刺激所述PBMC，完成初步擴增；S2、初步擴增完成后，淋巴免疫細胞與飼養(yǎng)層細胞混合，并加入唑來膦酸、OKT3抗體和重組人白細胞介素-2后繼續(xù)擴增。采用該方法，經(jīng)過兩次擴增后，免疫細胞總數(shù)可擴增達10000到80000倍，擴增后的免疫細胞包括αβT細胞,γδT細胞，NKT細胞和NK細胞，能直接殺死腫瘤細胞,或制備成細胞免疫治療藥物來殺死腫瘤細胞。
【IPC分類】A61K48/00, C12N5/0783, A61P35/00, A61K35/17
【公開號】CN105624107
【申請?zhí)枴緾N201510603692
【發(fā)明人】卓朗, 王暉, 王柯
【申請人】深圳市科暉瑞生物醫(yī)藥有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2015年9月21日