樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法和樹突狀細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，特別涉及一種樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法和樹突狀細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補(bǔ)了傳 統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療的弊端，已經(jīng)被公認(rèn)為二十一世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有 發(fā)展前途的一種治療手段，也是世界目前唯一有希望完全消滅腫瘤細(xì)胞的治療手段。
[0003] 細(xì)胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增 多，靶向性殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭w來(lái)殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變 的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。目前在 臨床中使用最多的細(xì)胞免疫治療療法主要是DC治療、CIK治療和DC-CIK聯(lián)合免疫治療。
[0004] DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)， 一方面，其能夠刺激初始的T細(xì)胞增殖，啟動(dòng)免疫應(yīng)答;另一方面，樹突狀細(xì)胞還能夠呈遞抗 原給MHC-I類限制性CD8+和MHC-II類限制性CD4+T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，被稱為 "天然免疫佐劑"，因此，樹突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特的地位。
[0005] 近年來(lái)，以樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療及DC疫苗已 取得較大進(jìn)展，體外制備的DC疫苗顯示出明顯誘發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力，具有良好的臨 床應(yīng)用前景。目前，從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)經(jīng)GM-CSF、IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的方法已基 本得到公認(rèn)，但DC體外促成熟的方案尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)主要采用TNF-a因子，但該方 法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12,致使培養(yǎng)得到的DC功能缺陷，很大程度 上限制了DC疫苗的臨床應(yīng)用工作的開展。因此，有必要對(duì)現(xiàn)有DC細(xì)胞培養(yǎng)方案進(jìn)行進(jìn)一步 完善，以有效提高DC疫苗在誘導(dǎo)抗炎或抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)出的樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟 率低，細(xì)胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一種能夠提高樹突狀細(xì)胞成熟率及抗 原提呈性能的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:提供一種樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法， 包括以下步驟：
[0008] 獲取樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)第一誘導(dǎo)劑培養(yǎng)4~7天，每隔2~3天更換培 養(yǎng)基，獲得未成熟樹突狀細(xì)胞；
[0009] 再添加第二誘導(dǎo)劑培養(yǎng)所述未成熟樹突狀細(xì)胞至樹突狀細(xì)胞成熟；
[0010] 其中，第一誘導(dǎo)劑包括:rhGM-CSF和rhIL-4;
[0011] 第二誘導(dǎo)劑包括rhTNF-α和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。
[0012] 在本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，所述第一誘導(dǎo)劑中，rhGM-CSF的濃度 為800 ~1200U/ml 和 rhIL-4 的濃度為800 ~1200U/ml。
[0013]在本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，所述第一誘導(dǎo)劑中，rhGM-CSF的濃度 為 1000U/ml 和 rhIL-4 的濃度為 1000U/ml。
[0014]在本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，所述第二誘導(dǎo)劑中，rhTNF-α的濃度為 800~1200U/ml和番茄脂溶性提取物的濃度為5~15μg/ml，或番茄水溶性提取物的濃度為5 ~15μg/ml〇
[0015] 在本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，所述第二誘導(dǎo)劑中，rhTNF-a的濃度為 1000U/ml和番茄脂溶性提取物的濃度為10μg/ml，或番茄水溶性提取物的濃度為10μg/ml。
[0016] 在本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，
[0017] 所述番茄脂溶性提取物的提取方法，包括以下步驟：
[0018] 避光條件下，取新鮮番茄處理成漿狀后，干燥至粉末狀;取番茄粉末加入乙醇-正 丁烷萃取液混勻，離心，收集上清液，向殘留物中添加正丁烷混勻，離心，再次收集上清液， 然后將收集的上清液混合，用蒸餾水和NaCl溶液清洗后，用氮?dú)獯蹈杉纯伞?br>[0019] 在本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，所述番茄水溶性提取物的提取方法， 包括以下步驟:避光條件下，取新鮮番茄處理成漿狀后，干燥至粉末狀;取番茄粉末，加入乙 醇，加熱至40~70°C、1~2小時(shí)，冷卻后離心;于相同條件下加熱冷卻離心并提取殘?jiān)鼉纱危?合并上清液，過(guò)濾備用。
[0020] 在本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，
[0021] 所述樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞的獲取過(guò)程，包括以下步驟：
[0022]抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋巴細(xì)胞分離液離心10~20分鐘后，分離獲取外周血 單個(gè)核細(xì)胞;用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素的 完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞濃度至(2~6) X 106個(gè)/ml，孵育1~3小時(shí)，更換新的完全培養(yǎng)基，收集 細(xì)胞懸液，即為樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞懸液。
[0023] 在本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，還包括以下步驟:添加所述第一誘導(dǎo) 劑之前，需調(diào)節(jié)所述樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞濃度為(1~3) X 106個(gè)/ml。
[0024] 本發(fā)明還提供一種樹突狀細(xì)胞，是由上述樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法所獲得的。
[0025] 實(shí)施本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，可以達(dá)到以下有益效果：與現(xiàn)有培養(yǎng) 樹突狀細(xì)胞的方式相比，本發(fā)明通過(guò)第一誘導(dǎo)劑和第二誘導(dǎo)劑對(duì)樹突狀細(xì)胞進(jìn)行兩個(gè)階段 的誘導(dǎo)活化，并采用番茄脂溶性提取物或水溶性提取物作為第二誘導(dǎo)劑，能夠促進(jìn)提高樹 突狀細(xì)胞的細(xì)胞活性，提高樹突狀細(xì)胞的增值率及成熟率，進(jìn)而提高樹突狀細(xì)胞的抗原提 呈性。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0027] S1、獲取樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞；
[0028] S2、采用第一誘導(dǎo)劑將樹突狀前體細(xì)胞當(dāng)個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成未成熟樹突狀細(xì) 胞；
[0029] S3、采用第二誘導(dǎo)劑將未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成熟的樹突狀細(xì)胞。
[0030] 具體地，步驟S1中，優(yōu)選地，樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源于新鮮外周血，相比 經(jīng)過(guò)冷庫(kù)儲(chǔ)存或者培養(yǎng)傳代之后的樹突狀細(xì)胞，從新鮮血液中制備的樹突狀細(xì)胞前體單個(gè) 核細(xì)胞離體時(shí)間較短，其細(xì)胞活性和狀態(tài)的減弱或者形態(tài)改變程度都較少，更加利于保持 其免疫性能。在本發(fā)明中，樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞的具體獲取過(guò)程為：
[0031]抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋巴細(xì)胞分離液離心10~20分鐘后，分離獲取外周血 單個(gè)核細(xì)胞；
[0032] 用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素的完全 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞濃度至(2~6) X106個(gè)/ml，孵育1~3小時(shí)，更換新的完全培養(yǎng)基，收集細(xì)胞 懸液，即為樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞懸液。
[0033] 步驟S2的具體過(guò)程為：
[0034] 取步驟S1獲得的樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞懸液，離心洗滌后計(jì)數(shù)，使細(xì)胞濃度 達(dá)到（1~3) X106個(gè)/ml，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并與培養(yǎng)當(dāng)天添加第一誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)4~7天， 每隔2~3天更換培養(yǎng)基。
[0035] 其中，第一誘導(dǎo)劑包括rhGM_CSF(Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，重組人粒-巨細(xì)胞集落刺激因子）和rhIL_4(Recombinant human interleukin 4,重組人白細(xì)胞介素4);其中，rhGM-CSF的終濃度為800~1200U/ml和 rhIL-4的終濃度為800~1200U/ml;更為優(yōu)選地，rhGM-CSF的終濃度為1000U/ml，rhIL-4的 終濃度為l〇〇〇U/ml。
[0036] 第一誘導(dǎo)劑所含成分能夠誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為未成熟的樹突 狀細(xì)胞，增大細(xì)胞體積，并促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞形成集落；同時(shí)，對(duì)已分化 的未成熟樹突狀細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激，使未成熟樹突狀細(xì)胞能夠快速成熟。
[0037]步驟S3的具體過(guò)程為：
[0038]向步驟S2a獲得的未成熟樹突狀細(xì)胞中添加第二誘導(dǎo)劑培養(yǎng)2~4天至未成熟的樹 突狀細(xì)胞全部成熟；其中，第二誘導(dǎo)劑包括rhTNF_a(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重組人腫瘤壞死因子α)和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物;且rhTNF-α的 終濃度為800~1200U/ml、番茄脂溶性提取物的終濃度為5~15μg/ml或番茄水溶性提取物 的濃度為5~15μg/ml;更為優(yōu)選地，rhTNF-α的終濃度為l〇〇〇U/ml，番茄脂溶性提取物的終 濃度為1 〇yg/m 1，番茄水溶性提取物的終濃度為10yg/m 1。
[0039]其中，rhTNF-a能夠刺激樹突狀細(xì)胞成熟，以提高樹突狀細(xì)胞抗原提呈能力。
[0040]番茄中有活性作用的主要脂溶性化合物為類胡蘿卜素，類胡蘿卜素及其他番茄脂溶 性提取物能夠促進(jìn)未成熟的樹突狀細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，抑制細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的H2〇2對(duì) 細(xì)胞膜的損傷，降低細(xì)胞R〇S、LP0含量，增加 S0D酶活性，減少DNA損傷，提高樹突狀細(xì)胞的活 性及存活率并促進(jìn)其成熟。番茄脂溶性提取物的提取方法為:取新鮮番茄處理成漿狀后，干 燥成粉末備用。取番茄粉末加入乙醇-正丁烷萃取液混勻，離心，收集上清液；向殘留物中添 加正丁烷混勻，離心，再次收集上清液;可重復(fù)該提取步驟2~3次，然后將收集的上清液混 合，用蒸餾水和NaCl溶液清洗后，用氮?dú)獯蹈?，溶解在甲?甲基叔丁基醚-水溶液中，過(guò)濾 備用;需要說(shuō)明的是，該提取步驟全程均在避光條件下操作，以防止類胡蘿卜素氧化。
[0041 ]番茄中有活性作用的主要水溶性化合物為酚類化合物，酚類化合物能夠清除細(xì)胞 代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，減少對(duì)細(xì)胞的損傷，提高樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞活性，促進(jìn)其增殖。 番茄水溶性提取物的提取方法為：取番茄粉末，加入乙醇提取液，加熱至40~70°C、1~2小 時(shí)，冷卻后離心;于相同條件下提取殘?jiān)鼉纱危喜⑸锨逡?，過(guò)濾備用。
[0042] 基于本發(fā)明的上述樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，本發(fā)明還提出一種由上述方法制備得 到的樹突狀細(xì)胞。
[0043] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以