解釋本發(fā)明，并不用于限 定本發(fā)明。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0046] Sla、獲取樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞；
[0047]抽取外周靜脈血3-5ml，生理鹽水1:1稀釋，然后沿管壁緩緩加入到3~5ml比重為 1 ·077±0 .OOlg/ml的Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液上，1500r/min離心15分鐘，分離獲取 外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含10 %胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基 (購自Gibco公司）懸浮細(xì)胞濃度為4X10 6/ml，移至六孔板中，2ml/孔，將六孔板放于37°C、 5 % C02培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，去掉培養(yǎng)基及懸浮的細(xì)胞，在每孔中放入新鮮的RPMI1640培養(yǎng) 基，輕輕吹打，吹起壁上細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，即樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞。
[0048] S2a、將樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成未成熟樹突狀細(xì)胞；
[0049] 將步驟Sla中獲得的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，離心洗滌，計(jì)數(shù)細(xì)胞，使細(xì)胞 濃度達(dá)到2 X 106/ml，然后用完全培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清RPMI1640)培養(yǎng)，并于培養(yǎng)當(dāng)天加 入第一誘導(dǎo)劑，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每隔3天更換新的培養(yǎng)基，并補(bǔ)充第一誘導(dǎo)劑，即可 收獲未成熟樹突狀細(xì)胞；
[0050] 其中，第一誘導(dǎo)劑中包括l〇〇〇U/ml的rhGM-CSF和 1000U/ml的rhIL-4。
[00511 S3a、誘導(dǎo)未成熟樹突狀細(xì)胞成熟；
[0052]在樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)的第6天加入第二誘導(dǎo)劑培養(yǎng)3天至樹突狀細(xì) 胞成熟；
[0053]第二誘導(dǎo)劑中包括1000U/ml的rhTNF-α和lOμg/ml的番茄脂溶性提取物。
[0054]其中，番茄脂溶性提取物的制備方法為：
[0055]取番茄原料洗凈后切成小塊，用攪拌器打成漿狀。稱取30g左右漿狀物冷凍干燥后 研磨成粉末，置于_80°C冰箱中備用。精確稱取0.5g番茄粉末置于50mL聚乙烯試管中，加入 10mL乙醇-正丁烷（乙醇與正丁烷的體積比為4:3)，混勻后先于150轉(zhuǎn)/min振蕩lh，然后在 4000轉(zhuǎn)/min的條件下離心3min，分離上清液，殘?jiān)屑尤?0mL正丁燒，并用上述相同方法重 復(fù)提取兩次。上清液合并后，用50mL蒸餾水和50mL 10 % NaCl溶液清洗，合并的上清液用氮 氣吹干后，溶解在10mL的methanol(甲醇)-MTBE(甲基叔丁基醚)-蒸餾水(90:5:5，v/v/v)溶 液中，過〇.2μπι的PTFE(聚四氟乙烯)濾膜備用。所有過程均在避光操作下進(jìn)行，防止類胡蘿卜 素氧化。
[0056] 實(shí)施例2
[0057]與實(shí)施例1的不同之處在于，本實(shí)施例中所采用的第二誘導(dǎo)劑包括：1000U/ml的 rhTNF-α和lOμg/ml的番茄水溶性提取物。
[0058]其中，番茄水溶性提取物的制備方法為：
[0059] 在100mL聚四氟乙稀微波提取管中準(zhǔn)確稱取0.5g番茄粉末，加入25mL乙醇提取液， 將微波提取管固定在微波提取裝置中，并接入溫度感應(yīng)器;根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置升溫程序， 5min內(nèi)加熱到預(yù)定的提取溫度55°C，樣品提取1小時(shí)后，冷卻lOmin，然后于4000rpm下離心 5min。相同條件下，重復(fù)提取殘?jiān)鼉纱?，合并后的上清液過0.2μπι的PTFE濾膜備用。
[0060]為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其所獲得的樹突狀細(xì)胞具 有顯著的有益效果，設(shè)置以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0061 ]檢測組1~2-分別對應(yīng)本發(fā)明實(shí)施例1~2所提供的成熟的樹突狀細(xì)胞；
[0062]對照組一為采用現(xiàn)有方法獲得的樹突狀細(xì)胞。
[0063] 1.細(xì)胞表型的FACS分析
[0064]分別收集檢測組和對照組3組樹突狀細(xì)胞，加入PBS溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度 至為IX 106/ml，取100μΙ加入離心管，然后分別加入熒光標(biāo)記抗體(抗⑶86、⑶11b、⑶11c及 I-Ab單抗)調(diào)整終濃度為5μg/ml，置4°C冰箱中，避光反應(yīng)15min，添加 roS溶液洗滌2遍，以熒 光標(biāo)記的同型Ig作為對照，上機(jī)(FACS calibur)檢測細(xì)胞焚光強(qiáng)度，Cellquest軟件分析。
[0065] 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組樹突狀細(xì)胞免疫分子表型熒光強(qiáng)度的比較(x±s)，檢測 結(jié)果如下表1:
[0066] 表 1
[0067]
[0068] 檢測結(jié)果:CD86含量高于CDllc和la說明樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子活化T細(xì)胞的 第二信號(hào)CD86高表達(dá)，由表1數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明提供的成熟的樹突狀細(xì)胞表面免疫分子活化 T細(xì)胞的能力較強(qiáng)。
[0069] 2. ELISA法測定細(xì)胞因子（IL-10和IL-12p70)的含量
[0070]分別收集檢測組1~3和對照組促成熟后的樹突狀細(xì)胞的上清液驚醒ELISA檢測， 檢測上清中IL-10與IL-12p70的分泌情況，檢測數(shù)據(jù)見下表2，IL-10與IL-12p70的分泌水平 (x±s)，（單位:pg/ml)
[0071] 表2
[0072]
[
[0074]檢測結(jié)果：由表2數(shù)據(jù)可知，檢測組1-3中，樹突狀細(xì)胞分泌的IL_12p70的水平遠(yuǎn)大 于IL-10,而IL-12p70能夠直接作用CD8+T細(xì)胞使其增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫效應(yīng)以及形成長久 記性T淋巴細(xì)胞，能夠分泌高水平的IL12是樹突狀細(xì)胞生物活性高的標(biāo)志之一；由此可知， 通過本發(fā)明所獲得的樹突狀細(xì)胞生物活性優(yōu)于對照組通過現(xiàn)有技術(shù)所獲的樹突狀細(xì)胞的 生物活性。
[0075] 3. CCK-8法抗原肽特異性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)
[0076] 分別對檢測組1~3和對照組細(xì)胞執(zhí)行以下操作：
[0077] 將抗原肽負(fù)載并促成熟后的樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)1:10的比率共培養(yǎng)5天 后，用CCK法檢測T細(xì)胞的增殖情況。
[0078] 表3為檢測組和對照組影響T細(xì)胞增殖反應(yīng)的比較（％，x土s)
L〇〇8〇」檢測結(jié)果:樹突狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞的一個(gè)重要的功能是刺激T細(xì)胞增殖，因 此，樹突狀細(xì)胞能否激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是檢驗(yàn)樹突狀細(xì)胞功能的關(guān)鍵問題。由表3中 數(shù)據(jù)可知，通過本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法所獲得的樹突狀細(xì)胞能夠促進(jìn)并提高 T細(xì)胞的增值率，增強(qiáng)免疫反應(yīng)能力。
[0081]以上對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方 式，上述的【具體實(shí)施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā) 明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這 些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 獲取樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)第一誘導(dǎo)劑培養(yǎng)4~7天，每隔2~3天更換培養(yǎng)基， 獲得未成熟樹突狀細(xì)胞； 再添加第二誘導(dǎo)劑培養(yǎng)所述未成熟樹突狀細(xì)胞至樹突狀細(xì)胞成熟； 其中，第一誘導(dǎo)劑包括:rhGM-CSF和rhIL-4; 第二誘導(dǎo)劑包括rhTNF-α和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第一誘導(dǎo)劑中， rhGM-CSF 的濃度為800 ~1200U/ml、和 rhIL-4 的濃度為800 ~1200U/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第一誘導(dǎo)劑中， rhGM-CSF 的濃度為 1000U/ml 和 rhIL-4 的濃度為 1000U/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第二誘導(dǎo)劑中， rhTNF-α的濃度為800~1200U/ml和番茄脂溶性提取物的濃度為5~15μg/ml，或番茄水溶性 提取物的濃度為5~15μg/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第二誘導(dǎo)劑中， rhTNF-a的濃度為l〇〇〇U/ml和番茄脂溶性提取物的濃度為10μg/ml，或番茄水溶性提取物的 濃度為lOμg/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述番茄脂溶性提取物 的提取方法，包括以下步驟： 避光條件下，取新鮮番茄處理成漿狀后，干燥至粉末狀；取番茄粉末加入乙醇-正丁烷 萃取液混勻，離心，收集上清液，向殘留物中添加正丁烷混勻，離心，再次收集上清液，然后 將收集的上清液混合，用蒸餾水和NaCl溶液清洗后，用氮?dú)獯蹈杉纯伞?. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述番茄水溶性提取物 的提取方法，包括以下步驟:避光條件下，取新鮮番茄處理成漿狀后，干燥至粉末狀;取番茄 粉末，加入乙醇，加熱至40~70°C、1~2小時(shí)，冷卻后離心;于相同條件下加熱冷卻離心并提 取殘?jiān)鼉纱?，合并上清液，過濾備用。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞前體單 個(gè)核細(xì)胞的獲取過程，包括以下步驟： 抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋巴細(xì)胞分離液離心10~20分鐘后，分離獲取外周血單個(gè) 核細(xì)胞；用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素的完全 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞濃度至(2~6) X106個(gè)/ml，孵育1~3小時(shí)，更換新的完全培養(yǎng)基，收集細(xì)胞 懸液，即為樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞懸液。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，還包括以下步驟:添加 所述第一誘導(dǎo)劑之前，需調(diào)節(jié)所述樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞濃度為(1~3) X 106個(gè)/ml。10. -種樹突狀細(xì)胞，其特征在于，是由權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng) 方法所獲得的。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：獲取樹突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)第一誘導(dǎo)劑培養(yǎng)4～7天，獲得未成熟樹突狀細(xì)胞；然后，再添加第二誘導(dǎo)劑培養(yǎng)所述未成熟樹突狀細(xì)胞至樹突狀細(xì)胞成熟；其中，第一誘導(dǎo)劑包括：rhGM-CSF和rhIL-4；第二誘導(dǎo)劑包括rhTNF-α、番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由上述方法所獲得的樹突狀細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法提高樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞活性，提高樹突狀細(xì)胞細(xì)胞的增值率及成熟率，進(jìn)而提高樹突狀細(xì)胞的抗原提呈性。
【IPC分類】C12N5/0784
【公開號(hào)】CN105624112
【申請?zhí)枴緾N201610109161
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月28日