非交叉反應(yīng)性抗IgG抗體的制作方法
【專利說明】非交叉反應(yīng)性抗I gG抗體
[0001 ]本申請為2010年10月18日提交的、發(fā)明名稱為"非交叉反應(yīng)性抗IgG抗體"的PCT申 請PCT/EP2010/065617的分案申請，所述PCT申請進(jìn)入中國國家階段的日期為2012年4月19 日，申請?zhí)枮?01080047203.6。
[0002] 本發(fā)明報(bào)導(dǎo)了特異性結(jié)合人和黑猩猩IgG類抗體的IgG-Fab片段的恒定區(qū)的抗體 及其在免疫測定中的用途。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 自從Koehler和Milstein在1974年開發(fā)了首例單克隆抗體以來，進(jìn)行了許多努力 以開發(fā)適用于治療人的抗體。首例可獲得的單克隆抗體已在小鼠和大鼠中被開發(fā)。在過去 10年中，越來越多的人單克隆抗體或人源化單克隆抗體已進(jìn)入市場。熟知的實(shí)例包括例如 來自F.Hoffmann-La Roche AG，Basel的Herceptin?和MabThera?。
[0005] 極大量的人或人源化抗體正在調(diào)查研究中，并在能夠考慮進(jìn)入人體進(jìn)行初步試驗(yàn) 以前需要在實(shí)驗(yàn)動物中研究。必須研究如生物可用性和抗體清除等（只提到其中2種）的重 要標(biāo)準(zhǔn)。許多這些研究需要在實(shí)驗(yàn)動物自身抗體的背景下定量治療抗體。在大多數(shù)情況下 使用哺乳動物作為實(shí)驗(yàn)動物。通常最先在嚙齒類如小鼠或大鼠中評估毒理學(xué)。在更高級的 藥物開發(fā)階段，特別是在藥物進(jìn)入人體以前，甚至必須將猴子包括在這樣的臨床前研究中。
[0006] 哺乳動物循環(huán)中通常具有約10至約30毫克/ml之間的抗體。治療單克隆抗體一般 必須以范圍從約1納克/ml至約100毫克/ml之間的血清水平進(jìn)行檢測。因此，必須在實(shí)驗(yàn)動 物抗體的背景下檢測治療抗體，所述實(shí)驗(yàn)動物抗體為約100倍至1千萬倍過量。
[0007] 在實(shí)驗(yàn)動物抗體的背景下檢測人或人源化治療抗體是對藥理學(xué)家的極為嚴(yán)峻的 任務(wù)。檢測動物與智人的親緣關(guān)系越近，人或人源化抗體的檢測就變得越來越困難。
[0008] 在TO 2008/031532中報(bào)導(dǎo)了一種抗藥物抗體測定。在TO 2006/066912中報(bào)導(dǎo)了在 實(shí)驗(yàn)動物中檢測治療抗體。在US 5，332，665中報(bào)導(dǎo)了物種特異性、高親和力的單克隆抗體。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明首先報(bào)導(dǎo)了在人和黑猩猩的G型免疫球蛋白的抗體上的構(gòu)象表位，其不存 在于通常使用的實(shí)驗(yàn)動物中。其次報(bào)導(dǎo)了與此表位結(jié)合的非交叉反應(yīng)性抗人IgG抗體和抗 黑猩猩IgG抗體。第三，報(bào)導(dǎo)了使用這些抗體的測定。
[0011] 本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的一個方面是結(jié)合人或黑猩猩IgG(G亞類的免疫球蛋白）但不結(jié)合犬 和絨猴(marmoset) IgG的抗體。
[0012]在一個實(shí)施方案中，所述抗體不結(jié)合犬、恒河猴(Rhesus-monkey)、絨猴、狒狒和食 蟹猴(cynomolgus)IgG。在另一個實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合人和黑猩猩IgG。在另外 的實(shí)施方案中，通過表面等離子共振測定的結(jié)合人或黑猩猩IgG的K D值是l(T9m〇l/l或更低， 結(jié)合犬、恒河猴、絨猴、狒狒和食蟹猴IgG的K D值是l(T6m〇l/l或更高。在一個實(shí)施方案中，結(jié) 合人或黑猩猩IgG的K D值是l(T9m〇l/l至l(T13m〇l/l。在另一個實(shí)施方案中，結(jié)合犬、恒河猴、 絨猴、狒狒和食蟹猴IgG的K D值不能通過表面等離子共振測定。在一個實(shí)施方案中，所述抗 體是單克隆抗體。
[0013]本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的另一個方面是特異性結(jié)合包含κ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的IgGl(Gl亞類的 免疫球蛋白）的抗體。
[0014] 在一個實(shí)施方案中，所述抗體還結(jié)合IgG2。在另一個實(shí)施方案中，所述抗體還結(jié)合 IgG4。在另一個實(shí)施方案中，所述抗體不結(jié)合IgG3。在一個實(shí)施方案中，所述抗體不結(jié)合包 含λ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的IgGl。在一個實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。
[0015] 本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的從細(xì)胞系DSM ACC3006(M-1.3.2)，DSM ACC3007(M-1.5.8)和DSM ACC3008(M-1.7.10)得到的抗體與例如細(xì)胞系DSMACC2708產(chǎn)生的抗體M-R10Z8E9比較時顯 示了降低的交叉反應(yīng)性，它們結(jié)合Fab區(qū)中的不同表位，不受鄰近的糖基化位點(diǎn)的影響，并 可在免疫測定中混合用于測定Fab治療抗體，因?yàn)槊糠N抗體的結(jié)合位點(diǎn)在Fab片段中僅出現(xiàn) 1次。
[0016] 本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的各方面是細(xì)胞系DSM ACC3006，DSM ACC3007和DSM ACC3008,以及從 所述細(xì)胞系得到的各個抗體和這些抗體在免疫測定中的用途。
[0017] 另一個方面是一種試劑盒，其包含
[0018] a)從DSM ACC3006,或DSM ACC3007,或DSM ACC3008,或DSM ACC2708得到的抗體的 生物素化形式，
[0019] b)從DSM ACC3006,或DSM ACC3007,或DSM ACC3008,或DSM ACC2708得到的抗體的 地高辛化(digoxygenylated)形式。
[0020] 本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的另一個方面是檢測從實(shí)驗(yàn)動物得到的樣品中的治療抗體的方法，其 包括以下步驟
[0021] a)提供待分析的樣品，
[0022] b)將所述樣品與和本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體結(jié)合相同表位的抗體孵育，
[0023] c)任選地將所述樣品與適于選擇性檢測總治療抗體、活性治療抗體或結(jié)合抗原的 治療抗體的試劑孵育，和
[0024] d)任選地通過校準(zhǔn)曲線將在(b)或(c)中形成的復(fù)合物與治療抗體的濃度相關(guān)聯(lián)。
[0025] 本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的另一個方面是使用包含捕獲抗體和示蹤抗體的抗原橋連免疫測定， 進(jìn)行免疫學(xué)測定從實(shí)驗(yàn)動物得到的樣品中的治療抗體的方法，其中所述捕獲抗體和示蹤抗 體都獨(dú)立地選自和本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體結(jié)合相同表位的抗體。
[0026] 在一個實(shí)施方案中，所述免疫測定是夾心免疫測定。在另一個實(shí)施方案中，抗體與 其綴合配偶體的綴合通過經(jīng)由抗體的氨基酸骨架的N-端和/或ε_氨基(賴氨酸）、不同賴氨 酸的氨基、羧基、巰基、羥基和/或酚官能團(tuán)，和/或抗體的碳水化合物結(jié)構(gòu)的糖醇基的化 學(xué)結(jié)合進(jìn)行。在另外的實(shí)施方案中，捕獲抗體通過特異性結(jié)合對固定。在一個實(shí)施方案中， 捕獲抗體與生物素綴合并通過固定化的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素進(jìn)行固定。在另一個 實(shí)施方案中，示蹤抗體通過特異性結(jié)合對與可檢測的標(biāo)記物綴合。在一個實(shí)施方案中，示蹤 抗體與地高辛綴合并通過針對地高辛的抗體進(jìn)行與可檢測的標(biāo)記物的連接。在另一個實(shí)施 方案中，治療抗體是Fab。在一個實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)動物選自絨猴和絹毛猴(tamarin)、舊大 陸猴(old world monkey)、侏儒狐猴和鼠狐猴(dwarf and mouse lemur)、長臂猿和小猿 (lesser ape)、美狐猴(true lemur)家族的成員，以及其雜種。在一個實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)動 物選自狗、恒河猴、絨猴、狒狒和食蟹猴。在一個實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)動物是獼猴（Macaca monkey)。在另一個實(shí)施方案中，結(jié)合治療抗體但不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動物的免疫球蛋白的抗體是本 發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體。在一個實(shí)施方案中，治療抗體是人或人源化抗體。在另一個實(shí)施方案中， 人或人源化抗體是單克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，檢測總治療抗體，在另一個實(shí)施方案中 檢測活性治療抗體，在另一個實(shí)施方案中檢測與其抗原結(jié)合的治療抗體。
[0027]本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的另一個方面是結(jié)合治療抗體但不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動物的免疫球蛋白的抗 體在測定從實(shí)驗(yàn)動物獲得的樣品中的總治療抗體、活性治療抗體或抗原結(jié)合的治療抗體的 濃度中的用途，其中所述抗體和本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體結(jié)合相同的表位。在一個實(shí)施方案中，所 述抗體是本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體。
[0028]本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的另一個方面是抗體組合物，其包含由細(xì)胞系DSM ACC3006、細(xì)胞系 DSM ACC3007、細(xì)胞系DSM ACC3008和/或細(xì)胞系DSM ACC2708產(chǎn)生的抗體的混合物。
[0029] 另一個方面是本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體組合物在本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的方法中的用途。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 名為M-R10Z8E9的非交叉反應(yīng)性抗人IgG抗體(從細(xì)胞系DSM ACC2708中獲得)結(jié)合 G型人免疫球蛋白的CH2結(jié)構(gòu)域中的靠近糖基化位點(diǎn)Asn297的表位。本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體Μ-?. 3. 2 ，M-1. 5.8和M-1.7.10與抗體M-R10Z8E9 相比顯示 了降低的交叉 反應(yīng)性 ，結(jié)合Fab區(qū)中 的不同表位，不受鄰近的糖基化位點(diǎn)的影響，且可在免疫測定中混合用于測定治療抗體，特 別是Fab治療抗體，因?yàn)槊糠N抗體的結(jié)合位點(diǎn)都在Fab片段中存在。
[0032] 術(shù)語"治療抗體"表示在臨床研究中檢測的被批準(zhǔn)用作人治療劑的抗體，且其可對 個體施用用于治療疾病。在一個實(shí)施方案中，治療抗體是單克隆抗體。在另一個實(shí)施方案 中，治療抗體選自從類人猿(great ape)得到的抗體，從用人抗體基因座轉(zhuǎn)化的動物得到的 抗體，人單克隆抗體，或人源化單克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，治療抗體是人單克隆抗體。 在另一個實(shí)施方案中，治療抗體是人源化單克隆抗體。治療抗體被廣泛用于多種疾病的治 療，例如腫瘤疾?。ɡ缪汉蛯?shí)體惡性腫瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌和結(jié)腸直腸 癌），免疫疾病，中樞神經(jīng)疾病，血管疾病或傳染病。這樣的抗體為，例如，針對CD20，CD22， HLA-DR，CD33，CD52，EGFR，G250，⑶3，HER2，PSMA，CD56，VEGF，VEGF2，CEA，Levis Y抗原，IL-6 受體(IL6R)或IGF-1受體(IGF1R)的抗體。
[0033] 術(shù)語"抗體"包含抗體結(jié)構(gòu)的多種形式，包括整個抗體和抗體片段。本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的 抗體在一個實(shí)施方案中是人抗體，人源化抗體，嵌合抗體，或T細(xì)胞抗原耗盡的抗體(T-cel 1 antigen depleted antibody)。例如在Morrison,S.L·，等人，Proc.Natl.Acad Sci.US