A 81 (1984)6851-6855;US 5,202,238和US 5,204,244;虹6(*1^1111丄.，等人，恥忉代 332(1988) 323-327 ;Neuberger，M.S.，等人，Nature 314(1985)268_270;Lonberg，N.， Nat .Biotechnol. 23(2005) 1117-1125 中描述了抗體的基因工程。
[0034] 非人(例如嚙齒類)抗體的"人源化"形式是包含來源于非人抗體和來源于人抗體 的部分序列的嵌合抗體。大部分人源化抗體來源于人抗體(接受體抗體），其中高變區(qū)的殘 基被具有期望的特異性和親和力的非人物種，例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的的高變區(qū) (供體抗體）的殘基替換。有時(shí)候，人抗體的框架區(qū)（FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。此外， 人源化抗體可包含另外的修飾，例如在接受體抗體或供體抗體中不存在的氨基酸殘基。這 樣的修飾導(dǎo)致這樣的接受體或供體抗體的變體，其與相應(yīng)的親本序列同源但不同一。進(jìn)行 這些修飾以進(jìn)一步改善抗體性能。
[0035] 大體上，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本全部，其中高變 環(huán)對(duì)應(yīng)非人供體抗體的高變環(huán)，F(xiàn)R的全部或基本全部是人接受體抗體的FR。人源化抗體任 選地也包含至少一部分抗體恒定區(qū)，通常是人抗體恒定區(qū)的一部分。
[0036] 人源化非人抗體的方法已在領(lǐng)域中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體具有一 個(gè)或多個(gè)從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為"輸入"殘基，其 一般來自"輸入"可變結(jié)構(gòu)域。可基本上遵照Winter及其同事的方法，通過將高變區(qū)序列取 代為相應(yīng)的非人抗體的序列進(jìn)行人源化。因此，這樣的"人源化"抗體是嵌合抗體，其中實(shí)質(zhì) 上少于完整的人可變結(jié)構(gòu)域的序列被來自非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)際上，人源化抗體 一般是人抗體，其中一些高變區(qū)殘基和可能有一些框架區(qū)殘基被來自嚙齒類或非人靈長(zhǎng)類 抗體的類似位點(diǎn)中的殘基取代。
[0037] 本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指從基本均質(zhì)的抗體群體中得到的抗體，即組成 群體的個(gè)體抗體是同一的，除了可能以少量存在的可能天然發(fā)生的突變以外。單克隆抗體 是高度特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與包含針對(duì)不同抗原位點(diǎn)(決定簇或表位)的不 同抗體的多克隆抗體制品相反，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)抗原位點(diǎn)。除了其特異 性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)在于其合成可不被其他抗體污染。修飾語(yǔ)"單克隆"表示抗體的 特征是從基本均質(zhì)的抗體群體中獲得，而不應(yīng)被視為需要通過任何特定方法產(chǎn)生所述抗 體。
[0038] 本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"實(shí)驗(yàn)動(dòng)物"表示以下靈長(zhǎng)目的各科成員，即包含絨猴和絹毛猴 (絨猴（Cal 1 i tr i chi dae )科），新大陸猴（卷尾猴（Cebidae )科），舊大陸猴（獼猴 (Cercopi thecidae )科，例如獼猴（Macaca monkey))，侏儒狐猴和鼠狐猴（鼠狐猴 (Cheirogaleidae)科），指狐猴(aye-aye)(指猴（Daubentoniidae)科），嬰猴（bushbaby)和 夜猴(galago)(嬰猴(Galagonidae)科），長(zhǎng)臂猿和小猿(長(zhǎng)臂猿(Hylobatidae)科），馬達(dá)加 斯加大狐猴（indris)，馬達(dá)加斯加狐猴(sifaka)，和其親屬(大狐猴（Indridae)科），美狐猴 (狐猴(Lemuridae)科），懶猴（1 orise)(懶猴(Loridae)科），嬉猴（sportive 1 emur)(嬉猴 (16區(qū)313(^丨(^)科），眼鏡猴(^18丨61')(眼鏡猴(^18；^(^)科），及其雜種。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選自絨猴和絹毛猴、舊大陸猴、侏儒狐猴和鼠狐猴、 長(zhǎng)臂猿和小猿、美狐猴各科的成員，及其雜種。在此實(shí)施方案中，排除了離人類最近的親屬， 類人猿，特別是黑猩猩、倭黑猩猩(bonobo)、大猩猩(gorilla)和猩猩(orangutan)的組。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"樣品"表示從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移取的任意組織或液體樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣 品可為液體樣品如唾液、尿、全血、血漿或血清。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品將為全血、血漿 或血清。
[0041] "結(jié)合治療抗體但不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體的抗體"將以至少l(T9m〇l/l的解離常數(shù)（= KDiss)，在另一個(gè)實(shí)施方案中以至少l(T1()m〇l/l的K Diss結(jié)合治療抗體。同時(shí)通過1〇Λι〇1/1或 更差的KDlss確保不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體的性能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合治療抗體但不結(jié) 合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體的抗體在分別針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的G型免疫球蛋白和針對(duì)人或黑猩猩的G型免 疫球蛋白的反應(yīng)性之間將具有至少100倍的K Diss差距。
[0042] 大體上，術(shù)語(yǔ)"結(jié)合"表示抗體以1 (T9mo 1 /1或更低的解離常數(shù)（=Kd = KDiss.)，在另 一個(gè)實(shí)施方案中以至少l(T1()mol/l的KD結(jié)合其抗原或相應(yīng)的抗體受體(看相應(yīng)的上下文而 定）。同時(shí)通過l(T 7m〇l/l或更高(例如l(T5m〇l/l)的K D確保不結(jié)合的性能。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，結(jié)合第一抗體但不結(jié)合第二抗體的抗體在分別針對(duì)第一種G型免疫球蛋白和針對(duì)第二 種G型免疫球蛋白的反應(yīng)性之間將具有至少100倍的K D差距。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方案中通過在BIAcore?.儀器上的表面等離子共振評(píng)估抗體的結(jié)合 性能，特別是KDlss。在此方法中，通過表面等離子共振(SPR)的變化評(píng)估結(jié)合性能?？杀憷?將研究中的抗體與固相（稱為芯片）結(jié)合并用于評(píng)估單克隆抗體、多克隆抗體或甚至包含 IgG的血清與此包被的芯片的結(jié)合。
[0044] 研究中的結(jié)合治療抗體但不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體的抗體可為單克隆抗體，這樣的抗 體的片段，以及包含這樣的抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因構(gòu)建體?？墒褂帽Ａ羯鲜鼋Y(jié)合治療抗 體但不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體的標(biāo)準(zhǔn)的任意抗體片段。
[0045] 可能必須在臨床前研究期間評(píng)估與治療抗體在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的應(yīng)用相關(guān)的多個(gè)方 面。在特定設(shè)置下，可能與分析存在的治療抗體的總量相關(guān)，或分析治療抗體的特定片段， 或治療抗體的特定修飾，或與抗原結(jié)合的治療抗體的濃度，或仍然能夠結(jié)合抗原的治療抗 體的部分(fraction)可能是重要的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體和方法可用于 分別檢測(cè)總治療抗體、活性治療抗體或結(jié)合抗原的治療抗體。
[0046] 術(shù)語(yǔ)"總治療抗體"表示檢測(cè)的任意抗體，與抗體是否有活性（即仍然可與其抗原 反應(yīng)）、無活性和/或結(jié)合抗原無關(guān)。
[0047] 術(shù)語(yǔ)"活性治療抗體"表示在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中存在的仍然能夠結(jié)合其抗原的治療抗體。 例如，這樣的抗體在其抗原結(jié)合位點(diǎn)上還未結(jié)合其抗原或任意其他分子。
[0048] 術(shù)語(yǔ)"結(jié)合抗原的治療抗體"表示在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的循環(huán)中存在的與其抗原結(jié)合的治 療抗體。
[0049] 可使用本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的抗體和方法直接檢測(cè)如上定義的總治療抗體、活性治療抗體 或結(jié)合抗原的治療抗體。另外，可以檢測(cè)無活性的治療抗體的其他形式，例如被抗藥物抗體 或抗個(gè)體基因型抗體或特別是中和抗藥物抗體結(jié)合的治療抗體。
[0050] 另外，也可以間接評(píng)估任意"無活性的治療抗體"。這樣的無活性的治療抗體可為， 例如與其抗原結(jié)合的治療抗體，或與交叉反應(yīng)性抗原結(jié)合的治療抗體，或被針對(duì)治療抗體 的自身或抗個(gè)體基因型抗體阻斷的治療抗體。如果總抗體量大于活性抗體和結(jié)合抗原的抗 體的和，將存在包含未與其相應(yīng)抗原結(jié)合的無活性抗體的另外一部分抗體。
[0051] 可在例如所謂的競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定系統(tǒng)或在所謂的夾心型測(cè)定系統(tǒng)中檢測(cè)總治療抗 體。這樣的測(cè)定可在一個(gè)不含洗滌步驟的實(shí)施方案(均質(zhì)免疫測(cè)定）中進(jìn)行，或在含有洗滌 步驟的另一個(gè)實(shí)施方案(異質(zhì)免疫測(cè)定）中進(jìn)行。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在夾心型免疫測(cè)定中檢測(cè)總治療抗體，其中結(jié)合治療抗體但 不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體的抗體在這樣的夾心測(cè)定的兩側(cè)使用。在這樣的夾心的一側(cè)使用的抗 體與固相結(jié)合或能夠與固相結(jié)合(通常被稱為捕獲抗體），而在這樣的夾心的另一側(cè)的抗體 以便于直接或間接檢測(cè)的方式被標(biāo)記(所謂的檢測(cè)抗體）。在這樣的夾心測(cè)定程序中結(jié)合的 檢測(cè)抗體的量與所研究的樣品中的治療抗體的量直接相關(guān)。
[0053] 可通過方便的現(xiàn)有技術(shù)程序?qū)崿F(xiàn)樣品中的活性治療抗體的檢測(cè)。然而，總治療抗 體或與其抗原結(jié)合的治療抗體的部分的檢測(cè)相當(dāng)復(fù)雜，并且需要相當(dāng)不同的測(cè)定設(shè)置，特 別是需要定制的試劑用于每個(gè)不同的測(cè)定。使用本發(fā)明報(bào)導(dǎo)的結(jié)合治療抗體但不結(jié)合實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物抗體的抗體，可以在彼此類似的檢測(cè)系統(tǒng)中評(píng)估活性治療抗體、總治療抗體或結(jié)合抗 原的治療抗體的部分。當(dāng)在這些治療抗體的不同部分之間進(jìn)行定量比較時(shí)，此類總治療抗 體、活性治療抗體或結(jié)合抗原的治療抗體的比較測(cè)定應(yīng)當(dāng)具有優(yōu)勢(shì)。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)置夾心型測(cè)定形式用于檢測(cè)活性治療抗體。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，結(jié)合治療抗體但不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體的抗體被用作捕獲抗體，且這樣的夾心測(cè)定 的檢測(cè)側(cè)使用標(biāo)記形式的抗原，或在結(jié)合抗原后使用不結(jié)合或不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合治療抗體識(shí)別的 表位的第二抗體，其中所述第二抗體是可特異性檢測(cè)的和/或以便于直接或間接檢測(cè)的方 式被標(biāo)記。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中以?shī)A心型測(cè)定的形式檢測(cè)結(jié)合抗原的治療抗體，使用結(jié)合治療 抗體但不結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體的抗體作為捕獲試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中在檢測(cè)中使用在不與 治療抗體的表位競(jìng)爭(zhēng)的表位上結(jié)合抗原的第二抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中以便于直接或間接 檢測(cè)的方式標(biāo)記第二抗體。
[0056]為了直接檢測(cè)，標(biāo)記組可選自任意已知的可檢測(cè)的標(biāo)記組，例如染料、發(fā)光標(biāo)記組 如化學(xué)發(fā)光組，例如吖啶酯或二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)，或熒光染料，例如熒光素、香豆 素、羅丹明、嗪、試鹵靈(resorufin)、青色素及其衍生物。標(biāo)記組的另外實(shí)例是發(fā)光金屬?gòu)?fù) 合物，例如釕或銪復(fù)合物，酶，例如用于ELISA或用于CEDIA(克隆酶供體免疫測(cè)定），和放射 性同位素。在信號(hào)發(fā)射組的一個(gè)實(shí)施方案中也使用可通過電子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的金屬螯合物 作為可檢測(cè)的標(biāo)記物，特別優(yōu)選釕螯合物。在一