核酸擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，因基因利用技術(shù)的發(fā)展，基因診斷、基因治療等利用基因的醫(yī)療受到矚 目，除此之外，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)領(lǐng)域也已開發(fā)出多種將基因用于鑒別品種、改良品種的方法。 作為用于利用基因的技術(shù)，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction)法等核酸 擴(kuò)增技術(shù)正在廣泛普及。近年來，開發(fā)了能夠在短時(shí)間內(nèi)得到核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的PCR裝 置（例如，專利文獻(xiàn)1)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0004] 專利文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2012-115208

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人等在使用了日本特開2012-115208中記載的PCR裝置的核酸擴(kuò)增 反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)如果縮短熱變性和退火/延伸時(shí)間，則有時(shí)核酸擴(kuò)增效率下降。于是，為了尋 找其原因并解決問題，進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過在該P(yáng)CR裝置中使用人工核酸，能夠 有效地進(jìn)行核酸擴(kuò)增。因此本發(fā)明的目的在于提供一種能夠高效地核酸擴(kuò)增的新的核酸擴(kuò) 增方法。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增方法，包含如下工序：將核酸擴(kuò)增反應(yīng)容 器的第1區(qū)域加熱到第1溫度的工序，其中，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器填充有核酸擴(kuò)增反應(yīng)液 和與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液相比比重小且不與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液混和的液體；將核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器 的第2區(qū)域加熱到比上述第1溫度低的第2溫度的工序；將第1配置切換到第2配置的工 序，其中，上述第1配置為第1區(qū)域在重力作用的方向位于第2區(qū)域的下方，第2配置為第2 區(qū)域在重力作用的方向位于第1區(qū)域的下方；以及，將第2配置切換到第1配置的工序；并 且，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液含有探針，探針含有人工核酸。探針與僅含有天然核酸的探針相比，可 以與模板核酸的結(jié)合力更大。人工核酸可以為LNA、3' -氨基-2'，4' -BNA、2'，4' -BNAC0C、 2'，4'-8熟％、？嫩、6熟或了嫩。人工核酸可以是1^熟。探針可以是被標(biāo)記過的探針。標(biāo)記 過的探針可以是進(jìn)行了 RI標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記。
[0008] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，該核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置包含如下 結(jié)構(gòu)：安裝部，可安裝填充有核酸擴(kuò)增反應(yīng)液和與所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)液相比比重小且不與 所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)液混和的液體的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器；第1加熱部，將所述核酸擴(kuò)增反應(yīng) 容器的第1區(qū)域加熱到第1溫度；第2加熱部，將所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的第2區(qū)域加熱到 第2溫度；以及，驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，對第1配置和第2配置進(jìn)行切換，所述第1配置為所述第1區(qū)域 在重力作用的方向位于所述第2區(qū)域的下方，所述第2配置為所述第2區(qū)域在重力作用的 方向位于所述第1區(qū)域的下方；并且，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液含有探針，探針含有人工核酸。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，可提供一種能夠有效地進(jìn)行核酸擴(kuò)增的新的核酸擴(kuò)增方法。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的截面圖。g表示重力 方向。
[0011] 圖2是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的升降式PCR裝置的立體圖。（A)表示關(guān)閉 蓋的狀態(tài)，（B)表示打開蓋的狀態(tài)。
[0012] 圖3是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的升降式PCR裝置的主體的分解立體圖。
[0013] 圖4是示意地表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的升降式PCR裝置的主體的沿圖 2㈧的A-A線的截面的截面圖。㈧表示第1配置，（B)表示第2配置。
[0014] 圖5是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式和比較例中的表示核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物量的熒 光亮度測定值與熱循環(huán)數(shù)的關(guān)系的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)及其構(gòu)思根據(jù)本說明書的記載對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言 是明確的，根據(jù)本說明書的記載，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下記 載的發(fā)明的實(shí)施方式和具體的實(shí)施例等表示本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，是用于例示或說明而 示出的，本發(fā)明不限于這些。在本說明書中公開的本發(fā)明的意圖和范圍內(nèi)，基于本說明書的 記載，可以進(jìn)行各種改變和修飾，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明確的。
[0016] (1)核酸擴(kuò)增方法
[0017] 本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的特征在于，包含如下工序：將核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的第1 區(qū)域加熱到第1溫度的工序，其中，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器填充有核酸擴(kuò)增反應(yīng)液和與核 酸擴(kuò)增反應(yīng)液相比比重小且不與上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)液混和的液體；將核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的 第2區(qū)域加熱到比第1溫度低的第2溫度的工序；將第1配置切換到第2配置的工序，其 中，上述第1配置為第1區(qū)域在重力作用的方向位于上述第2區(qū)域的下方，上述第2配置為 第2區(qū)域在重力作用的方向位于第1區(qū)域的下方；以及，將第2配置切換到上述第1配置的 工序；并且，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液含有探針，探針含有人工核酸。
[0018] 核酸擴(kuò)增反應(yīng)液可含有核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑和擴(kuò)增對象的靶核酸。作為靶核酸， 例如，可舉出由血液、尿、唾液、腦脊髓液、組織等被檢測物制備得到的DNA，或?qū)⒂蛇@些被檢 測物制備得到的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的cDNA等。核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑可含有用于擴(kuò)增靶核酸的 引物對、緩沖液、聚合酶、dNTP、MgCl 2和用于對靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的熒光標(biāo)記等。 DNA聚合酶沒有特別限定，優(yōu)選耐熱性的酶、PCR用酶，例如，Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚 合酶或者它們的改良型等大量市售品，優(yōu)選進(jìn)行熱啟動(dòng)的DNA聚合酶。dNTP、鹽的濃度只要 為對于使用的酶而言適當(dāng)?shù)臐舛燃纯桑ǔ？梢詾槿缦聺舛龋菏筪NTP為10~1000 μΜ，優(yōu) 選100~500 μ Μ，使Mg2+為1~lOOmM，優(yōu)選5~10mM，使C1為1~2000mM，優(yōu)選200~ 700mM，對總離子濃度沒有特別限定，可以為高于50mM的濃度，優(yōu)選高于100mM的濃度，更優(yōu) 選高于120mM的濃度，進(jìn)一步優(yōu)選高于150mM的濃度，進(jìn)一步優(yōu)選高于200mM的濃度。上限 優(yōu)選500mM以下，更優(yōu)選300mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選200mM以下。引物用寡聚核苷酸分別使用 0. 1~10 μ M，優(yōu)選使用0. 1~1 μ M。
[0019] 本發(fā)明中，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液含有包含人工核酸的探針。本說明書中，人工核酸是 指可通過氫鍵能夠與DNA、RNA的堿基鍵合的天然核酸分子以外的核酸分子。本發(fā)明中使 用的人工核酸的種類沒有特別限定，但特別優(yōu)選與僅由天然核酸構(gòu)成的探針相比，使探針 與互補(bǔ)鏈的Tm值變高、與模板核酸的結(jié)合力提高的人工核酸，優(yōu)選使核酸的核糖環(huán)的2' 位的氧原子與4'位的碳原子進(jìn)行亞甲基交聯(lián)的2'，4' -BNA(2' -0,4' -C-甲醇交聯(lián)核 酸，2' _0,4' -C-methano-bridged nucleic acid，別名 LNA(鎖核酸，Locked Nucleic Acid))。以下示出LNA的化學(xué)式。 「00201
[0021 ] 上述式中，堿基可舉出T (胸腺嘧啶）、C(胞嘧啶）、G(鳥嘧啶）、A(腺嘌呤）、U(尿 嘧啶）、1(肌苷）等作為例子，沒有特別限定。也可以是用甲基化、乙酰化等修飾而得到的 堿基。另外，也可以使用對LNA進(jìn)行修飾而得的LNA類似物，可例示3'氨基-2'，4' -BNA、 2'，4' -BNA·、或 2'，4' 3熟％等。或者使用 PNA(核酸肽，P印tide Nucleic Acid)、 GNA (Glycol Nucleic Acid)、或 TNA(蘇糖核酸，Threose Nucleic Acid)、或?qū)λ鼈冞M(jìn)行修 飾的類似物。LNA類似物以及PNA、GNA、TNA和它們的類似物也與LNA同樣地不限定堿基。
[0022] 探針?biāo)械娜斯ず怂岬臄?shù)量沒有特別限定，可根據(jù)靶核酸、探針的排列等而任 意設(shè)定。一個(gè)探針可以具有多種人工核酸。
[0023] 含有人工核酸的探針優(yōu)選為了檢測靶核酸的擴(kuò)增而進(jìn)行了標(biāo)記。標(biāo)記的種類沒有 特別限定，可以根據(jù)目的從TaqMan(注冊商標(biāo)）MGB探針（AppliedBiosystems)等焚光標(biāo) 記、SYBR Green(注冊商標(biāo)）等嵌入劑、以32P為代表的放射性同位素（RI)等放射性物質(zhì)標(biāo) 記、以生物素、異羥基洋地黃毒甙元為代表的酶標(biāo)記等可得到的標(biāo)記中任意地選擇。含有人 工核酸的探針的制造方法也沒有特別限定，可用公知的方法制造。
[0024] 這里，Tm值是指雙鏈的核酸的50%解離成單鏈的核酸的溫度，即解鏈溫度 (Melting Temperature)。Tm值的計(jì)算方法沒有特別限定，通常可以單獨(dú)使用或組合使用 GC%法、最鄰近喊基對法、或Wallace法進(jìn)彳丁計(jì)算。
[0025] 通過使用含有這樣的人工核酸的探針，與使用僅含有天然核酸的探針的情況相 比，擴(kuò)增的引發(fā)更快，在相同的循環(huán)數(shù)下可更多地得到核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，還能夠更多地得 到最終產(chǎn)物。換言之，如果將變性溫度、退火溫度、延伸溫度設(shè)為一定值，則通過使用含有人 工核酸的探針，與使用了僅含有天然核酸的探針的情況相比，能夠在更短時(shí)間內(nèi)得到相同 量的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0026] 核酸擴(kuò)增反應(yīng)液還可以含有表面活性劑。表面活性劑沒有特別限定，可例示NP40、 TritonX-100、Tween20等。表面活性劑的濃度沒有特別限定，優(yōu)選不阻礙核酸擴(kuò)增反應(yīng)的濃 度，可以為〇· 001 %~〇· 1 %以下，優(yōu)選為〇· 002 %~0· 02 %，最優(yōu)選為(λ 005 %~(λ 01 %。 表面活性劑可以從上述的酶的儲(chǔ)液帶入，也可以與上述的酶的儲(chǔ)液相獨(dú)立地將表面活性劑 溶液添加到核酸擴(kuò)增反應(yīng)液。
[0027] 對于液體130,通過使用不與反應(yīng)液140混和的物質(zhì)，將反應(yīng)液140加入容器150 時(shí)，反應(yīng)液140與液體130相分離，因