此在液體130中可使反應(yīng)液140形成為液滴狀。這樣， 反應(yīng)液140在液體130中能夠以液滴狀保持。
[0028] 液體130優(yōu)選比重小于反應(yīng)液140的液體。這種情況下，將反應(yīng)液140加入液體 130時，由于反應(yīng)液140的液滴比重大于液體130,所以受重力作用向重力作用的方向移動。 另外，液體130也可以為比重大于反應(yīng)液140的液體。這種情況下，由于反應(yīng)液140的液滴 比重小于液體130,受重力作用朝向與重力作用的方向相反的方向移動。
[0029] 液體130優(yōu)選含有油，例如，可使用硅油或礦物油。這里，硅酮是指作為主骨架具 有硅氧烷鍵的低聚物或聚合物。本說明書中，將硅酮中的在用于熱循環(huán)處理的溫度帶中為 液體狀態(tài)的物質(zhì)特別稱為硅油。另外，在本說明書中，將由石油精制且在用于熱循環(huán)處理 的溫度帶中為液體的物質(zhì)稱為礦物油。這些油對熱的穩(wěn)定性高，例如還易于得到粘度為 5X 103Nsm 2以下的制品，因此適用于升降型的PCR〇
[0030] 作為硅油，可例不 Shinetsu Silicone 公司制的 KF-96L-0· 65cs、KF_96L_lcs、 KF-96L-2cs、KF-96L-5cs、Dow Corning Toray 公司制的 SH200 C FLUID 5 CS、或者 Momentive Performance Materials Japan 合同會社制的 TSF451-5A、TSF451_10 等二甲基 硅油。作為礦物油，可例示含有碳原子數(shù)14~20左右的烷烴作為主成分。即，例示出正 十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十四烷。
[0031] 液體130可以含有添加劑。作為添加劑，例如，可使用X-22-160AS、X-22-3701E、 KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005(以上，Shinetsu Silicone 公 司）等改性硅油，SR1000、SS4230、SS4267、YR3370(以上，Momentiv公司）等硅酮樹 月旨，XS66-C1191 (Momentive社）等氟改性硅酮樹脂等，除此之外，TSF4703、TSF4708、 XF42-C5196、XF42-C5197(以上，Momentive公司）等改性硅油。添加劑的濃度沒有特別限 定，可考慮容器的結(jié)構(gòu)、材質(zhì)、形狀等來決定。例如，優(yōu)選為1% (v/v)~50% (v/v)，更優(yōu)選 為 2% (v/v)~20% (v/v)，進(jìn)一步優(yōu)選為 5% (v/v)。
[0032] 以下，作為本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的一個實施方式，對基于往返PCR(2個梯度溫 度PCR)的核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行說明。往返PCR是通過對反應(yīng)液實施反復(fù)進(jìn)行高溫和低溫的2 個梯度的溫度處理從而擴(kuò)增反應(yīng)液中的核酸的方法。在高溫處理中發(fā)生雙鏈DNA的解離， 在低溫處理中發(fā)生退火（引物與單鏈DNA結(jié)合的反應(yīng)）和延伸反應(yīng)（以引物為起點合成 DNA的互補(bǔ)鏈的反應(yīng)）。
[0033] 本發(fā)明的方法中，使用填充有核酸擴(kuò)增反應(yīng)液和與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液相比比重小且 不與上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)液混和的液體的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器將核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的第1區(qū) 域加熱到第1溫度，將核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的第2區(qū)域加熱到比第1溫度更低的第2溫度。這 里，從第1區(qū)域到第2區(qū)域形成溫度變低的溫度梯度。將第1溫度設(shè)為適于雙鏈DNA的解 離的溫度，將第2溫度設(shè)為適于退火和延伸反應(yīng)的溫度，將第1區(qū)域在重力作用的方向位于 上述第2區(qū)域的下方的第1配置保持一定時間進(jìn)行雙鏈DNA的解離，將第2區(qū)域在重力作 用的方向位于第1區(qū)域的下方的第2配置保持一定時間進(jìn)行退火和延伸反應(yīng)。通過將該第 1和第2配置切換一定次數(shù)來擴(kuò)增核酸。因為核酸擴(kuò)增反應(yīng)液和液體的比重不同，所以核酸 擴(kuò)增反應(yīng)液在第1配置中位于第1區(qū)域，在第2配置中位于第2區(qū)域。
[0034] 通常，往返PCR中的高溫為80°C~100°C之間的溫度，低溫為50°C~70°C之間的 溫度。一般在各溫度下的處理進(jìn)行規(guī)定時間，保持高溫的時間比保持低溫的時間短。例如， 可以設(shè)為高溫為1秒~10秒左右，低溫為10秒~60秒左右，也可以根據(jù)反應(yīng)條件而設(shè)為 與比上述時間更長的時間，但優(yōu)選保持低溫的時間短的情況，可以為18秒以下，優(yōu)選為12 秒以下，更優(yōu)選為6秒以下。
[0035] 此外，適當(dāng)?shù)臅r間、溫度和循環(huán)數(shù)（反復(fù)高溫和低溫的次數(shù)）根據(jù)使用的試劑的種 類和用量而不同，所以優(yōu)選在考慮試劑的種類、核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的量而決定適當(dāng)?shù)姆桨傅?基礎(chǔ)上進(jìn)行反應(yīng)。
[0036] 另外，在本實施方式中，作為核酸擴(kuò)增方法，可以使用在兩種溫度下進(jìn)行核酸擴(kuò)增 反應(yīng)的往返PCR進(jìn)行說明，也可以使用在熱變性、退火和延伸反應(yīng)中改變溫度的PCR法（3 個梯度溫度PCR)。此時，除退火溫度以外設(shè)定延伸反應(yīng)溫度，之后以規(guī)定時間維持于延伸反 應(yīng)溫度即可。
[0037] (2)核酸反應(yīng)擴(kuò)增容器
[0038] 作為本發(fā)明的一個實施方式，以下對本發(fā)明的方法中使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器進(jìn) 行說明。本發(fā)明的方法中使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器含有核酸擴(kuò)增反應(yīng)液和與核酸擴(kuò)增反應(yīng) 液比重不同且不與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液混和的液體，具有封閉的容器，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液為液滴 狀且液體含有油和添加劑。
[0039] 圖1是核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100的截面圖。圖1表示在核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器中裝入了 反應(yīng)液的狀態(tài)。
[0040] 本發(fā)明中使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100包含容器150和密封部120而構(gòu)成。核酸 擴(kuò)增反應(yīng)容器100的大小、形狀沒有特別限定，例如，可以考慮不與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液140 (以 下均稱為反應(yīng)液140)混和的液體130的量、熱導(dǎo)系數(shù)、容器150和密封部120的形狀、或操 作的容易程度中的至少一個而設(shè)計得到。液體130和核酸擴(kuò)增反應(yīng)液140可選自"（1)核 酸擴(kuò)增方法"中記載的物質(zhì)。
[0041] 核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100的容器150可以由透明的材質(zhì)形成。因此，可以從核酸擴(kuò) 增反應(yīng)容器100的外部對容器150內(nèi)的反應(yīng)液140的移動進(jìn)行觀察，或者可以用于實時PCR 等的從容器150的外部進(jìn)行測定等的用途。應(yīng)予說明，本說明書中稱為"透明"的情況是指 能夠確保從容器150的外部對容器150內(nèi)的反應(yīng)液140進(jìn)行觀察的程度的可視性，只要滿 足該條件，可以不必使核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100的整體為透明。
[0042] 核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100的用途沒有特別限定，例如用于實時PCR這樣的伴有熒光 測定的用途時，容器150優(yōu)選由自發(fā)熒光小的材質(zhì)形成。容器150優(yōu)選為可耐受PCR中的 加熱的材質(zhì)。而且，容器150的材質(zhì)優(yōu)選為核酸、蛋白質(zhì)的吸附少且不阻礙基于聚合酶等的 酶反應(yīng)的材質(zhì)。作為滿足這些條件的材質(zhì)沒有特別限定，例如，可以為聚丙烯、聚乙烯、環(huán)烯 烴聚合物（例如，ΖΕ0ΝΕΧ (注冊商標(biāo)）480R)、耐熱玻璃（例如PYREX (注冊商標(biāo)）玻璃）等、 這些復(fù)合材料，優(yōu)選聚丙烯。
[0043] 在圖1所示的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100中，容器150形成為圓筒狀，中心軸向（圖1 中的上下方向）為長邊方向。這里使用的容器150優(yōu)選為管，也可以為小型離心用管、用于 PCR而設(shè)計得到的管，但通過具有長邊方向，即為細(xì)長的形狀，例如，使用后述的升降型的加 熱循環(huán)器，在容器150內(nèi)的液體130中以形成溫度不同的區(qū)域的方式對核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器 100進(jìn)行溫度控制時，容易拉長不同溫度區(qū)域之間的距離。由此，易于對應(yīng)容器150內(nèi)的每 個區(qū)域?qū)⒁后w130控制為不同的溫度，所以能夠?qū)崿F(xiàn)適于PCR的熱循環(huán)。應(yīng)予說明，升降型 的加熱循環(huán)器是指通過在充滿容器150的液體中形成至少2個溫度區(qū)域，使與液體相分離 的反應(yīng)液140在這些溫度區(qū)域間往返移動而實現(xiàn)熱循環(huán)的裝置。
[0044] 容器150的形狀只要具有長邊方向，就沒有特別限定，用于升降型PCR裝置時，在 大致圓筒形狀中內(nèi)徑D與長邊方向的長度L之比優(yōu)選為1:5~1. 5:20的范圍。而且，內(nèi)徑 D更優(yōu)選為1. 5~2mm，長度L更優(yōu)選為10~20mm〇
[0045] 容器150具有開口部和密封開口部的密封部120,容器150中含有反應(yīng)液140和與 反應(yīng)液140比重不同且相分離的液體130。通過密封部120密封開口部時，優(yōu)選在容器150 內(nèi)不殘留空氣。因為如果在容器150內(nèi)殘留氣泡，則妨礙反應(yīng)液140的移動。密封部120可 由與容器150相同的材質(zhì)形成。密封部120的結(jié)構(gòu)只要是能夠密封容器150的結(jié)構(gòu)即可， 例如，可以為螺旋帽、栓、嵌入等結(jié)構(gòu)。在圖1中，密封部120為螺旋帽的結(jié)構(gòu)。
[0046] (3)核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置的裝置構(gòu)成
[0047] 在本實施方式中，作為進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器，使用管型的核酸 擴(kuò)增反應(yīng)用管100。以下，將PCR作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的一個例子，對適于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用管 100的升降式核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置（以下，均稱為升降式PCR裝置）的一個例子進(jìn)行詳細(xì)說 明。應(yīng)予說明，對于升降式PCR裝置，在日本特開2012-115208中進(jìn)行了詳細(xì)公開。
[0048] 圖2表示升降式PCR裝置1的一個例子。圖2㈧表示關(guān)閉升降式PCR裝置1的 蓋50的狀態(tài)，圖2(B)表示打開升降式PCR裝置1的蓋50的狀態(tài)，即表示在安裝部11安裝 有核酸擴(kuò)增反應(yīng)用管100的狀態(tài)。圖3是實施方式所涉及的升降式PCR裝置1中的主體10 的分解立體圖。圖4是示意地表示實施方式所涉及的升降式PCR裝置1中的主體10的沿 圖2(A)的A-A線的截面的截面圖。
[0049] 如圖2 (A)所示，該升降式PCR裝置1包含主體10和驅(qū)動機(jī)構(gòu)20。如圖3所示，主 體10包含安裝部11、第1加熱部12和第2加熱部13。在第1加熱部12與第2加熱部13 之間設(shè)有隔離件14。在本實施方式的主體10中，第1加熱部12配置于底板17的一側(cè)，第 2加熱部13配置于蓋50的一側(cè)