一種種子和棉花纖維優(yōu)勢表達(dá)啟動子PSDP_d及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉一種種子和棉花纖維優(yōu)勢表達(dá)的啟動子及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上第一大天然纖維作物，作為重要的紡織 原料，棉纖維具有重要的經(jīng)濟價值。棉花又是最重要的油料作物，據(jù)統(tǒng)計，棉花是我國第三 大油料作物，世界第六大油料作物。近十年(2004~2013)全國的棉花產(chǎn)量穩(wěn)定在600萬噸到 750萬噸之間（中國統(tǒng)計年鑒2014)，全國每年約有1500~1800萬噸的棉籽產(chǎn)量，棉籽中含有 豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，是一個巨大的可利用資源。
[0003] 棉纖維是棉花所特有的一種種子表皮細(xì)胞，是從胚珠表皮細(xì)胞分化而來的單細(xì) 胞，這一特性就決定了棉花種子發(fā)育與纖維發(fā)育之間的不可分割的關(guān)系。棉花纖維是重要 的紡織工業(yè)原料，我國是棉紡織品消費和出口大國，因此，棉花生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有 重要的地位。能否迅速提高我國棉花品種的纖維品質(zhì)，直接關(guān)系到我國棉花產(chǎn)業(yè)的興衰和 紡織品生產(chǎn)加工、紡織設(shè)備制造、外貿(mào)出口等行業(yè)的生存與發(fā)展。雖然利用傳統(tǒng)的育種方法 曾在棉花品種改良上取得了很大的成功，但近20年來，世界棉花品種在產(chǎn)量上已經(jīng)達(dá)到一 個平臺期，利用現(xiàn)有的遺傳資源和育種手段難以再大幅度提高棉花產(chǎn)量（Meredith W.R.Better Crops 2000 84(4):6~9)。單純依靠常規(guī)育種改良棉花纖維品質(zhì)相當(dāng)困難。
[0004] 這是因為：1)棉花纖維強力、細(xì)度等品質(zhì)性狀基因與皮棉產(chǎn)量存在負(fù)連鎖，常規(guī)育 種方法很難打破這種遺傳上的負(fù)相關(guān);2)我國的棉花栽培品種主要是陸地棉，而優(yōu)良纖維 品質(zhì)基因主要源于二倍體的瑟伯氏棉(纖維強度）、異常棉(纖維強度與細(xì)度）以及四倍體的 海島棉（纖維強度與細(xì)度)等，這些優(yōu)良性利用基因工程的方法可以打破物種間的遺傳障 礙，實現(xiàn)目的基因的定向轉(zhuǎn)移，同時具有后代易于穩(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點。但是，外源基因 的導(dǎo)入可能會對植物生長和發(fā)育產(chǎn)生有害作用。在這種情況下，基因表達(dá)需要被限制在期 望的目標(biāo)組織中。啟動子是RNA聚合酶能夠特異識別的一段DNA分子，也就是使轉(zhuǎn)錄開始的 部位。在基因表達(dá)的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)調(diào)控的第一步，也是關(guān)鍵一步(Lewi，2005基因 VIII 669~705,北京:科學(xué)出版社）。啟動子對外源基因在生物體中的表達(dá)時間、部位及水 平影響很大，是基因工程表達(dá)載體的重要元件。在棉花纖維品質(zhì)的基因工程改良中，往往需 要外源基因特異或優(yōu)勢地在纖維細(xì)胞中表達(dá)，從而降低外源基因?qū)γ藁ㄕＩL的影響。 如果采用棉花纖維優(yōu)勢啟動子，則可以使目的基因的表達(dá)主要控制在纖維中。另外，棉纖維 是由種子表皮細(xì)胞伸長發(fā)育而來，種子的生長狀態(tài)同樣會對纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)形成產(chǎn)生影 響。因此，棉花纖維或種子優(yōu)勢啟動子的克隆，對棉花纖維發(fā)育的基因功能研究和纖維品質(zhì) 的基因工程改良，都具有十分重要的價值。
[0005] 前人通過利用纖維特異啟動子，嘗試通過生物工程技術(shù)改良棉花纖維的品質(zhì)，已 有成功的報道。John等（John M E，Keller G.Metabolic Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 1996， 93:12768-12773)將乙酰CoA還原酶基因（phaB)和PHB合成酶基因（phaC)分別置于纖維特異 性啟動子E6和FbL2A的控制下并轉(zhuǎn)入陸地棉中，成功獲得同時表達(dá)phaB和phaC基因的轉(zhuǎn)基 因棉花。轉(zhuǎn)基因棉花分析發(fā)現(xiàn)棉株纖維中不僅有phaB和phaC的特異表達(dá)，而且含有PHB顆 粒。HPLC分析結(jié)果表明：PHB的合成始于開花后10d，每克纖維干重含約30-3440yg的PHB并維 持到纖維成熟，而且PHB的存在的確提高了纖維的熱絕緣性能。
[0006] 在基因工程改良棉纖維方面頗為人們關(guān)注的另一個焦點是美國Auburn大學(xué) Daniell的研究工作。Daniell(Henry Daniell，Beltwide Cotton Conferences，1998,595 ~598)試圖將編碼含Val-Pro-Gly-Val-Gly重復(fù)單元的蛋白聚體（protein-based p 〇lymerS，PBPS)基因遺傳轉(zhuǎn)化棉花，使棉花細(xì)胞能特異表達(dá)出PBPs蛋白。PBPs蛋白廣泛存 在于自然界中，如哺乳動物結(jié)締組織中的彈性蛋白，分子內(nèi)含有由多個氨基酸組成的重復(fù) 順序，PBPs分子常表現(xiàn)出較強的彈性(彈性系數(shù)10.6~10.9Pa)。Danie 11 (Henry Danie 11， Beltwide Cotton Conferences，1998，595~598)認(rèn)為將PHBs引進(jìn)棉纖維，一方面有望提高 纖維的彈性和強度，另一方面纖維中蛋白質(zhì)含量的提高，纖維吸水能力增強，與染料的親和 力亦相應(yīng)增強，這是目前常規(guī)育種方法所做不到的。
[0007] 特異啟動子在棉花基因工程育種中的重要性，在Zhang等人的工作中表現(xiàn)的更為 突出（Zhang，et al，Nature Biotechnology，2011，29:453-458) eZhang等利用單克隆抗體 原位雜交技術(shù)對IAA進(jìn)行細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)IAA在開花當(dāng)天的棉花纖維起始細(xì)胞中高濃度積 累；而無纖維突變體則沒有明顯的ΙΑΑ信號，表明ΙΑΑ對棉花纖維細(xì)胞的起始具有十分重要 的作用。棉花纖維細(xì)胞是由胚珠外珠被表層細(xì)胞經(jīng)分化突起、伸長而形成的。研究表明，只 有開花后5天之內(nèi)突起的表皮細(xì)胞(約占10%左右)可以發(fā)育成為具有紡紗價值的長纖維。 他們根據(jù)"生長素在棉花纖維突起細(xì)胞中極性分布"這一發(fā)現(xiàn)，分析了前人利用生長素改良 棉花纖維失敗的原因。認(rèn)為必須把生長素的極性分布與棉花纖維細(xì)胞發(fā)育的特點結(jié)合起 來，利用特異啟動子對生長素合成酶基因進(jìn)行特定部位、時間和強度上的精確調(diào)控，方能達(dá) 到改良纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的目的。于是他們將來自矮牽牛而且表達(dá)活性區(qū)在胚珠外表皮，控 制基因表達(dá)的時間在開花前2天到開花后8天的FBP7啟動子，與生長素生物合成基因 iaaM融 合并導(dǎo)入棉花中。轉(zhuǎn)基因棉花表型分析結(jié)果表明，不僅胚珠表面纖維數(shù)目增加、衣分得到提 高，而且纖維細(xì)度也得到改良，即轉(zhuǎn)基因棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)得到同步改良。先鋒公司部 門副總裁Michael Lassner認(rèn)為，該研究"清楚地證明了啟動子的選擇在性狀改良上的重要 性"（《Faculty of 1000》，2011年9月14日）。"展現(xiàn)了新一代轉(zhuǎn)基因作物的光明前景" (Jeffrey Chen，Nature Biotechnology，2011，29(5):407_409)〇
[0008] 棉花種子或纖維特異啟動子在棉花基因工程改良中的巨大價值，使這類啟動子得 到克隆。然而，目前能用于棉花基因改良的啟動子仍然非常有限，因此，獲得更多棉花種子 或纖維優(yōu)勢表達(dá)啟動子，不僅對今后棉花纖維的基因工程改良和纖維發(fā)育基因功能研究， 而且對利用異源基因的生物反應(yīng)器均具有重要的利用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種種子和棉花纖維優(yōu)勢表達(dá)啟動子PSDP_d，所述啟動子具 有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0010] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了含有所述PSDP_d啟動子的表達(dá)載體。其中所述表達(dá)載 體優(yōu)選植物表達(dá)載體，更優(yōu)選如圖6所示結(jié)構(gòu)的載體。
[0011] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體為根癌農(nóng)桿菌。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述動子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中所述 轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因棉花和番茄。
[0014] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種利用動子制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括 下述步驟：
[0015] ⑴構(gòu)建具有如SEQ ID No.l所示序列的啟動子；
[0016] (2)將所述啟動子可操作地插入表達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體；
[0017] (3)將步驟(2)獲得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，獲得轉(zhuǎn)化體；
[0018] (4)將所述轉(zhuǎn)