本發(fā)明進(jìn)行限 定，任何對本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求 所定義的范圍。
[0051] 本發(fā)明實例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明 的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell ,2001)。
[0052] 實施例1陸地棉各個組織RNA的提取及定量PCR分析
[0053] 利用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab)提取棉花各個組織的RNA。參照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)說明書進(jìn)行cDNA-鏈的逆轉(zhuǎn)錄，用作 定量RT-PCR分析模板。采用iQ SYBR Green Supermix(BIO-RAD)試劑分析目的基因的相對 表達(dá)量。內(nèi)標(biāo)基因選擇陸地棉的Ghhis3基因(AF024716)，引物為Ghhisl和Ghhis2分別如SEQ ID N0.8和SEQ ID如.9所示；61150?基因定量？0?引物為61150?-1?1'卯和61150?-1^(111分別如 SEQ ID N0.2和SEQ ID如.3所示。擴(kuò)增條件為：95°(：預(yù)變性3111丨11;95°(：變性2〇8,56°(：退火 20s，72 °C延伸30s，40個循環(huán)。
[0054]利用Bio-Rad CFX 3.0軟件，通過計算各材料中目的基因和內(nèi)標(biāo)的比值，可得目的 基因在不同器官組織中的相對表達(dá)量。結(jié)果如圖1所示，該基因在野生型陸地棉的葉片、胚 珠(開花后〇d和9d)、纖維(開花后9d)中表達(dá)較低，在花萼和下胚軸中的表達(dá)較高;進(jìn)一步比 較該基因在纖維發(fā)育的不同階段的表達(dá)發(fā)現(xiàn):在開花后15d以后的纖維中表達(dá)較高，表明該 基因?qū)儆诶w維發(fā)育中后期優(yōu)勢表達(dá)基因。
[0055] 實施例2陸地棉PSDP_d啟動子的克隆
[0056]采用艾德萊生物公司新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，按照說明書的方法提 取陸地棉冀棉14(該陸地棉品種由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬峙英教授惠贈）的基因組DNA，用設(shè)計合 成的該啟動子的特異引物PSDP_d-up和PSDP_d-dn(SEQIDN0.4和5)，以上述的DNA為模板， 擴(kuò)增該啟動子序列。擴(kuò)增體系如下：10 XPCR buffer for K0D Plus 5yL，25mmolMgS〇4 5μ L，2mmo 1 /L dNTPs 2yL，引物PSDP_d-up (5μπιο 1 /L) 2yL，引物PSDP_d-dn (5μπιο 1 /L) 2yL，K0D Plus聚合酶lU/yL，陸地棉D(zhuǎn)NA約60ng，雙蒸水補(bǔ)足至50yL。擴(kuò)增程序為：94°C，2min; 94°C， 15sec，53°C，30sec，68°C，2min，35個循環(huán)。擴(kuò)增完成后，瓊脂糖電泳并回收相應(yīng)DNA條帶，按 照說明書的方法克隆至pEASY_Blunt平端載體上，陽性克隆寄至上海英俊公司測序驗證，得 到pEASY-PSDP_d載體（見圖4)及PSDP_d啟動子序列如SEQ ID NO. 1所示。利用分析軟件 (Plant CARE，http: //intra .psb .ugent · be: 8080/PlantCARE/)，從植物啟動子數(shù)據(jù)庫中對 該序列進(jìn)行啟動子調(diào)控元件分析，發(fā)現(xiàn)該序列中含有多種植物激素如赤霉素響應(yīng)元件GARE (TCTGTTG 577-583)、生長素響應(yīng)元件TGA-box(TGACGTAA 1768-1775)，脫落酸響應(yīng)元件 ABRE(CACGTG 645-650)茉莉酸響應(yīng)元件TGACG-motif (TGACG 1768-1772)和胚乳特異相關(guān) 的GCN4(TGTGTCA 1441-1447)特異表達(dá)元件，逆境脅迫反應(yīng)如低溫LTR(CCGAAA 587-593)、 傷害WUN(TCATTACGAA 1777-1786)、壓力TC-富集重復(fù)區(qū)（GTTTTCTTAC 813-822 587-596)等 相關(guān)元件。該序列中還包含多個厭氧誘導(dǎo)元件ARE(TGGTTT 2226-2231、2299-2304、2397-2404、2482-2487)，與1^轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)的冊3(了44(^108-114)，細(xì)胞周期和晝夜 節(jié)律相關(guān)的circadian(CAANNNNATC 626-632 752-758)，多個GATA-box、CATA-box、AAGAA-motif等大量順式調(diào)控元件及與TFII結(jié)合的核心序列TATAA(圖3)。
[0057]實施例3DNA片段回收、表達(dá)載體構(gòu)建并大腸桿菌轉(zhuǎn)化
[0058] DNA的瓊脂糖電泳結(jié)束后，在紫外燈下用潔凈的刀片切下含目的片段的瓊脂糖凝 膠塊，按照試劑盒(Roche公司）的方法回收相應(yīng)的DNA片段，構(gòu)建到pBI 101上。載體構(gòu)建的具 體流程見圖5,首先從該啟動子的克隆載體pEASY-PSDP_d中利用限制性內(nèi)切酶Spel和EcoRV 將啟動子片段切出，然后克隆到表達(dá)載體PBI101的Xbal和Smal位點(diǎn)中并置于GUS報告基因 上游，從而構(gòu)建pBI 10l-PSDP_c^^正向表達(dá)載體（圖6)。所有限制性內(nèi)切酶均購自Roche公 司，按照使用說明書操作。
[0059]回收的片段與載體片段的連接體系為：10XT4DNA連接緩沖液lyL，載體DNA片段1μ L，外源連接產(chǎn)物DNA片段lyL，T4DNA連接酶lyL，用雙蒸水補(bǔ)足體積至10yL。其中，載體DNA片 段與外源連接產(chǎn)物DNA片段摩爾比為1:3,16°C連接12h。之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5a 中。
[0060]實施例4農(nóng)桿菌及番茄和棉花的遺傳轉(zhuǎn)化
[00611用電擊法將構(gòu)建的植物表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。
[0062] 按照OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒(D6943-01)說明書的步驟，提取pB 1101 -?30?_(1植 物表達(dá)載體質(zhì)粒，參考Bio-RAD MicroPulser用戶說明書，通過電激轉(zhuǎn)化法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng) 桿菌LBA4404中。
[0063]番前的遺傳轉(zhuǎn)化：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉轉(zhuǎn)化法（J · S · C · Van Roeke 1，B · Damm， L.S.Melchers,A.Hoekema Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicon esculentum)Plant Cell Rep. ,12(1993),pp.644-647)，對番前進(jìn)行遺傳 轉(zhuǎn)化，番茄材料為購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場的品種紅丹。將獲得的轉(zhuǎn)基因番茄植株通過PCR擴(kuò)增的 方法進(jìn)行篩選，采用艾德萊生物公司新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，按照說明書的方 法提取轉(zhuǎn)基因番茄的DNA，然后將PCR呈陽性的植株種植于溫室中，常規(guī)管理。
[0064]陸地棉的遺傳轉(zhuǎn)化：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對陸地棉冀棉14進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化（Luo et al.，2007)，將獲得的轉(zhuǎn)基因棉花植株通過PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行篩選，采用艾德萊生物公 司新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，按照說明書的方法提取轉(zhuǎn)基因棉花的DNA，然后進(jìn) 行PCR擴(kuò)增鑒定，將陽性的幼苗置于清水中，22°C培養(yǎng)1周后移栽至溫室中，進(jìn)行正常管理。 [0065] 實施例5轉(zhuǎn)基因植株的PCR驗證
[0066] 采用艾德萊生物公司新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，按照說明書的方法提 取轉(zhuǎn)基因番茄和棉花的D N A。根據(jù)G U S報告基因的序列設(shè)計特異引物G U S - 1 : AGCGTAATGCTCTACACCACG(SEQ ID N0.6)和⑶S-2:GTAATGCG AGGTACGGTAGG(SEQ ID N0.7) 用于特異PCR擴(kuò)增。轉(zhuǎn)基因植株DNA進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增驗證的條件：反應(yīng)總體積為25yL，包括 10XLA Taq buffer 2.5yL、每種dNTP 100ymol/L、1.5mmol/L MgCl2、模板DNA 10ng、上下 游引物各400nmol/L、l單位LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司）。
[0067] 擴(kuò)增條件:94°C變性4min，繼以94°C變性30s、55°