一種檢測致病性犬鉤端螺旋體的熒光pcr引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測引物與試劑盒，具體地說，涉及檢測致病性犬鉤端螺旋體的熒光 PCR引物、探針及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉤端螺旋體病(Leptospirosis)是一種在全世界范圍傳播的人畜共患疾病，簡稱 鉤體病，該病尤其廣泛存在于發(fā)展中國家和熱帶地區(qū)。犬對該病易感，感染后臨床表現(xiàn)多 樣，不易進(jìn)行診斷。鉤體病的病原體會持續(xù)存在于宿主機(jī)體內(nèi)，會進(jìn)一步擴(kuò)散污染環(huán)境，感 染其他人和動(dòng)物，危害嚴(yán)重。因而，犬患該病后，在危害其本身的健康的同時(shí)，還會威脅到其 主人的安全。因此，需要在早期對該病作出診斷，盡早控制該病。目前，診斷犬鉤體病的方法 有直接鏡檢、分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測、動(dòng)物接種等實(shí)驗(yàn)室檢測方法，與這些方法相比，PCR方 法更省時(shí)省力，特異性和敏感性優(yōu)異，并且可用于鉤體病的早期診斷。
[0003][0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種省時(shí)省力，特異性和 敏感性優(yōu)異，檢測犬鉤端螺旋體LigB基因的PCR引物及試劑盒，可用于犬鉤端螺旋體病的早 期診斷。
[0006] 本發(fā)明原理在于選擇了犬鉤端螺旋體LigB基因作為檢測對象，并針對犬鉤端螺旋 體LigB基因特殊設(shè)計(jì)了引物，使引物具有優(yōu)異的特異性和敏感性。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明提供一種檢測致病性犬鉤端螺旋體的PCR引物，所述引物如下：
[0009] 上游引物：5' -CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA -3' ；
[0010] 下游引物：5 ' -GATCCTTGTATTCCACCGATG-3 ' ；
[0011] 所述探針為：
[0012] 5 '-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3 '。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述引物與探針在制備檢測致病性犬鉤端螺旋體的試劑盒方面 的應(yīng)用。
[0014] 由于所述引物的擴(kuò)增片段能夠證明犬鉤端螺旋體LigB基因的存在，從而證明致病 性犬鉤端螺旋體的存在，因此，所述引物可用來制備檢測致病性犬鉤端螺旋體的試劑盒。
[0015] 在所述引物的存在下，加入配合使用的所述探針，能都在熒光PCR儀上進(jìn)行熒光定 量PCR的檢測。
[0016] 基于上述原因，本發(fā)明還提供了含有所述引物與探針的試劑或試劑盒。
[0017] 具體為一種檢測致病性犬鉤端螺旋體的試劑盒，所述試劑盒包括前述引物和探 針、陽性對照、陰性對照、Taq酶、dNTP、10 X Buf f er、ddH20。
[0018] 進(jìn)一步地，所述陽性對照的構(gòu)建方法為：
[0019 ] 1)以黃疸出血56601的基因組DNA作為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，與pMD18-T進(jìn)行連接；
[0020] 2)向Transl-Tl克隆感受態(tài)中加入步驟1)獲得的連接產(chǎn)物，篩選陽性克隆，提取質(zhì) 粒。
[0021] 黃疸出血5 6 6 01購自中國藥品生物制品檢定所鉤端螺旋體實(shí)驗(yàn)室，保藏編號為 56601 〇
[0022]為了更好的實(shí)現(xiàn)對致病性犬鉤端螺旋體的檢測，本發(fā)明優(yōu)化了所述試劑盒的工作 程序(尤其是退火溫度），使所述引物能夠最大程度地增加反應(yīng)成功率和反應(yīng)效果。
[0023]優(yōu)化得到的工作程序?yàn)椋?br>[0024] 94Γ 3min; 94Γ 20s，58 °C 50s，讀板，35 個(gè)循環(huán)。
[0025] 應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR以后，把得到的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，就可以得 出鉤體的濃度。對鉤體的檢測定性就夠了，但能定量更好，本試劑盒不但能定性，還能定量。 為了更好的實(shí)現(xiàn)對致病性犬鉤端螺旋體的熒光定量檢測，本發(fā)明還優(yōu)化了所述試劑盒的工 作體系(尤其是引物濃度和探針濃度），最大程度地提高靈敏度，降低檢出限。
[0026] 優(yōu)化得到的PCR工作體系為20yL:Premix Ex TaqlOyL，上下游引物各0.8yL，Probe 0.6yL，模板 lyL，ddH20 補(bǔ)足。
[0027] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0028] 本發(fā)明選擇LigB基因作為檢測對象，實(shí)現(xiàn)檢測致病性鉤端螺旋體的目的。本發(fā)明 提供了省時(shí)省力，特異性和敏感性優(yōu)異，檢測犬鉤端螺旋體LigB基因的PCR引物、探針及試 劑盒。本發(fā)明提供的引物、探針和試劑盒，可用于犬鉤端螺旋體病的早期診斷在該實(shí)驗(yàn)中， 建立并組裝的犬鉤體病熒光定量PCR試劑盒檢測靈敏度為lOVopies/yL，鉤體濃度檢測靈 敏度為1 X 101鉤體/mL，可滿足檢測需要。
【附圖說明】
[0029]圖1是本發(fā)明實(shí)施例2中退火溫度的電泳檢測結(jié)果圖；其中，M:2000bp Marker，泳 道1 ~5:退火溫度依次為56°C，57°C，58°C，59°C，60°C。
[0030]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中摸索引物濃度的結(jié)果圖：其中，上下游引物反應(yīng)終濃度梯 度為0.1~0.8μΜ，間隔為0. ΙμΜ。
[0031 ]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中摸索探針濃度的結(jié)果圖：探針反應(yīng)終濃度梯度為0.1~0.5 HM，間隔為0. ΙμΜ。
[0032]圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中DNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖：其中每一條曲線對應(yīng)一定濃度的 DNA模板。從左至右，曲線代表的DNA模板濃度依次為1，10-1，10-2，10- 3，10-4，10-5，10-6ng/yL， 相應(yīng)的檢測到的擴(kuò)增起始循環(huán)數(shù)依次增大。
[0033]圖5是本發(fā)明實(shí)施例3中DNA標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，X軸從左到右依次為DNA模板濃度 1，10-1，10-2，10-3，10-4，10- 5，10-6ng/yL，Y 軸為 CT 值。
[0034]圖6是本發(fā)明實(shí)施例4中熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，是3個(gè)不同濃度鉤體DNA標(biāo) 準(zhǔn)品的3個(gè)重復(fù)。
[0035] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例5中特異性試驗(yàn)曲線圖，其中從左到右為標(biāo)準(zhǔn)菌株黃疸出血 56601，犬56603，波摩那56608，流感傷寒56609，七日熱56610，塔拉索夫56635，非致病性鉤 體566505和空白對照。
[0036] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例8中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量PCR結(jié)果圖，從左至右，每一條曲線 代表的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒濃度依次為10°~1〇 8。
[0037] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例8中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中X軸為CT值，Y軸位lg(濃度 copies/uL)，分別為 105~10°copies/uL。
[0038] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例8中最低檢測鉤體菌液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中，X軸位lg (菌液 濃度），從左到右依次為101~1〇7鉤體/ml，Y軸位CT值。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí) 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
[0040] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0041] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042] 1、菌株和臨床樣本
[0043] 鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株黃疸出血56601，犬56603,波摩那56608,流感傷寒56609,七 日熱56610,塔拉索夫56635,非致病性鉤體566505,由課題所在實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)保存。
[0044] 2、主要儀器和試劑
[0045] 凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（北京六一儀器廠，中國）；梯度PCR儀(Biometra UNO，德 國）；C02恒溫培養(yǎng)箱(SANYO,日本），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及膠回收試劑盒購自天根 公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，；Taq酶、pMD_18t載體、Transl-Tl克隆感受態(tài)購 自大連寶生物有限公司；胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，氨芐青霉素購自NEB公司，氯化鈉、 瓊脂糖等常規(guī)試劑購自國產(chǎn)公司。
[0046] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)與合成
[0047] 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的LigB基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)得到 引物，經(jīng)篩選得到本發(fā)明所述的引物。
[0048] 篩選得到的引物通過NCBI中的BLAST進(jìn)行特異性鑒定，如表1所示。引物均由大連 寶生物公司合成。
[0049] 表1通用引物序列
[0050]
[0051 ]實(shí)施例2熒光定量PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化
[0052] 1、根據(jù)細(xì)菌組DNA提取試劑盒產(chǎn)品說明，從生長良好的黃疸出血56601菌液提取 DNA作為模板，首先對PCR反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行摸索，反應(yīng)體系為20yL體系：Premix Ex TaqlOyL，上下游引物各0 · 8yL，Probe 0 · 6yL，模板lyL，ddH20補(bǔ)足。
[0053]在梯度PCR儀上進(jìn)行，設(shè)置溫度梯度為：56.0 °C，57.0 °C，58.0 °C，59.0 °C，60.0 °C。 以摸索出的最佳退火溫度，進(jìn)行引物濃度的優(yōu)化。結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，當(dāng)退火溫度 為58.0 °C時(shí)，條帶最亮，檢測效果最好。
[0054] 2、保持Taq酶，dNTP，探針，10 X Buf f er，模板的加樣量及終濃度不變，對上下游引 物進(jìn)行梯度稀釋加樣，用去離子水進(jìn)行補(bǔ)足，使上下游引物反應(yīng)終濃度梯度為〇. 1~〇. 8μΜ， 間隔為Ο.ΙμΜ。選取得到平均最低CT值時(shí)的引物濃度。結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，引物濃度 為0.4μΜ時(shí)，平均C