T值最低。
[0055] 3、以摸索出的最佳退火溫度和摸索出的最佳引物濃度，進(jìn)行探針濃度的優(yōu)化，保 持Taq酶，dNTP，10 X Buf fer，上下游引物，模板的加樣量不變，對(duì)探針進(jìn)行梯度稀釋加樣，使 探針反應(yīng)終濃度梯度為0.1~0.5μΜ，間隔為0. ΙμΜ。選取得到平均最低CT值時(shí)的引物濃度。 結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，探針濃度為0.3μΜ時(shí)，平均CT值最低。
[0056]實(shí)施例3靈敏度試驗(yàn)
[0057]將實(shí)施例2提取的DNA模板經(jīng)過定量作為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成lng/yL，而后進(jìn)行10倍梯 度稀釋，分別稀釋成lng/yL~lXl(T6ngAiL。利用實(shí)施例2優(yōu)化得到的PCR體系和工作程序進(jìn) 行熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4、圖5。由圖4、圖5可知，y = -3.0832Xlog(DNA含量/μ L)+31.468，r2為0.997，線性關(guān)系良好，對(duì)基因含量的檢測靈敏度的可達(dá)到1 X l(T6AiL。
[0058] 實(shí)施例4重復(fù)性試驗(yàn)
[0059] 選取3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模版，分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)濃度的標(biāo) 準(zhǔn)品進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，計(jì)算變異系數(shù)，對(duì)該方法的重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果如圖6所示。由圖6可 知，變異系數(shù)為〇. 23~0.93 %，重復(fù)性良好，該檢測方法穩(wěn)定。
[0060] 實(shí)施例5特異性試驗(yàn)
[0061 ]分別以標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA、非致病性鉤體566505的DNA和空白對(duì)照為模板，利用實(shí)施 例1所述引物和探針進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，檢驗(yàn)該方法的特異性。
[0062]其中，標(biāo)準(zhǔn)菌株為最易對(duì)犬致病的鉤體菌株，包括:黃疸出血56601，犬56603,波摩 那56608，流感傷寒56609，七日熱56610，塔拉索夫56635。
[0063] 檢驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，僅致病性鉤體出現(xiàn)擴(kuò)增，非致病性鉤體和空白對(duì) 照均未出現(xiàn)擴(kuò)增。有良好的特異性。
[0064] 實(shí)施例6構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒(陽性對(duì)照）
[0065] 以提取自波摩那56608的DNA作為模板，利用實(shí)施例1所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行5 管 10yL 反應(yīng)，941€3111丨11;941€3〇8,581€3〇8,72 1€3〇8,29個(gè)循環(huán)；721€5111丨11。將？0?反應(yīng)液加入 配好2%的瓊脂糖凝膠中，以120V電壓進(jìn)行25分鐘電泳，而后在紫外燈下觀測后，快速對(duì)電 泳純化后的目的片段進(jìn)行切取?；厥漳康幕蚱嗡玫哪康幕蚺cpMD 18-T進(jìn)行，連接 的反應(yīng)體系如下：pMD 18-T vector 0.5yL、PCR產(chǎn)物4.5yL、Solution I 5yL。在4°C冰箱中 進(jìn)行過夜連接反應(yīng)。
[0066] 從一 80°C冰箱取出Transl-Tl克隆感受態(tài)，進(jìn)行冰浴溶解。而后無菌操作迅速加入 l〇yL連接產(chǎn)物，用移液槍進(jìn)行緩慢輕微吹打混勻。而后進(jìn)行30min冰浴，靜置。在此期間，準(zhǔn) 備好42 °C水浴，冰浴結(jié)束后42 °C水浴熱激30秒，而后快速冰浴2分鐘，整個(gè)過程中不可搖動(dòng) 離心管。加入500yL經(jīng)過預(yù)熱的LB培養(yǎng)基(不含抗性），而后置于37°C，200rpm搖床培養(yǎng)lh。然 后進(jìn)行6000rpm離心2min，棄掉上清，留200yL吹打混勻，吸取100yL菌液涂于Amp抗性LB固體 培養(yǎng)基平板上，37 °C溫箱放置30min后，倒置繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)過夜12h。
[0067]無菌操作，挑取轉(zhuǎn)化平板上菌落接入含Amp抗性LB液體培養(yǎng)基的試管中，做好標(biāo) 記，置于37°C，200rpm搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，最遲12個(gè)小時(shí)，取生長渾濁菌液試管進(jìn)行PCR鑒定， 可擴(kuò)增出符合目的片段大小者，可初步視對(duì)應(yīng)試管內(nèi)的菌液為陽性克隆。并對(duì)陽性菌液進(jìn) 行重新擴(kuò)大培養(yǎng)，為下一步提取質(zhì)粒做準(zhǔn)備。
[0068] 選取實(shí)驗(yàn)中P C R鑒定為陽性者的菌液，送往生工公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果為： CTTGGGATTCTTCTAATACCGATATTCTCTCAATTT CCAATGCAAGTGATAGCCACGGATTAGCTTCCACACTCAACCAA GGGAATGTTAAAGTCACTGCTTCCATCGGTGGAATACAAGGATC。并用甘油保存該管菌液重新擴(kuò)大培養(yǎng) 的菌液放置于-80 °C冰箱備用。每管保存lmL，其中甘油與菌液比例為3:7。
[0069] 按質(zhì)粒提取試劑盒產(chǎn)品說明提取質(zhì)粒。
[0070] 實(shí)施例7試劑盒的組裝
[0071]熒光定量PCR檢測試劑盒中，包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照制品各一管，上游和下游引 物各一管，探針一管，Premix Ex Taq-管，ddH20-管。其中陽性對(duì)照制品是實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（如實(shí)施例6所得），陰性對(duì)照為無菌ddH20,上下游引物濃度為ΙΟμΜ，探針濃度 為10μΜ。保存條件為-20°C。
[0072]實(shí)施例8試劑盒參數(shù)檢測 [0073] 1、靈敏度檢測：
[0074] (1)梯度稀釋定量過的所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測（圖 8)，標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒，10°~108,最低檢測濃度為lOlopies/yL，并構(gòu)建相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖9)，在 105~10Qcopies/yL的稀釋度范圍內(nèi)，關(guān)系式為y = -0.339X+11 · 24，1"2 = 0.998。線性關(guān)系良 好。。
[0075] (2)選取生長良好的56601鉤體菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，稀釋成108菌體/mL，提取菌體基因 組DNA，而后用培養(yǎng)基對(duì)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，熒光定量PCR檢測并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖 10,線性公式7 = -3.2243計(jì)31.1244軸為18(菌液濃度），￥軸為(：1'值，濃度？ = 0.9943，相關(guān) 性較好。最低檢測鉤體菌液濃度為1 X 101鉤體/mL。鉤體濃度檢測靈敏度為1 X 101鉤體/mL， 可滿足檢測需要。
[0076] 2、特異性檢測：對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株黃疸出血56601，犬56603,波摩那56608,流感傷寒 56609，七日熱56610，塔拉索夫56635，非致病性鉤體566505和空白對(duì)照進(jìn)行檢測。僅致病性 鉤體呈陽性，非鉤體和空白對(duì)照均為陰性。
[0077] 3、重復(fù)性檢測:選取3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)濃度的標(biāo) 準(zhǔn)品進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，計(jì)算變異系數(shù)，驗(yàn)證方法的重復(fù)性，重復(fù)性良好。
[0078] 4、確定保存期:將試劑盒置于-20Γ下保存，間隔兩周進(jìn)行檢測，確定其保存期。經(jīng) 過六個(gè)月后，檢測結(jié)果依然良好，確定保存條件為_20°C，保存期最短為六個(gè)月。
[0079] 5、試劑盒檢出率檢測：臨床采集犬血液和尿液樣品，以鉤體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法顯 微凝集試驗(yàn)(MAT)方法，和建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測，對(duì)比檢出率。熒光定量PCR方 法檢測出的陽性樣本與MAT方法檢出陽性樣本數(shù)一致，檢出率良好。
[0080]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測致病性犬鉤端螺旋體的PCR引物與探針，其特征在于，所述引物如下： 上游引物：5 ' -CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3 ' ； 下游引物：5 ' -GATCCTTGTATTCCACCGATG-3 ' ； 所述探針為： 5 '-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3 '。2. 權(quán)利要求1所述的引物與探針在制備檢測致病性犬鉤端螺旋體的試劑盒方面的應(yīng) 用。3. 含有權(quán)利要求1所述引物與探針的試劑或試劑盒。4. 一種檢測致病性犬鉤端螺旋體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:權(quán)利要求1 所述的PCR引物與探針、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、Taq酶、dNTP、10 X Buf f er、ddH20。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對(duì)照的構(gòu)建方法為： 1) 以56608菌株的基因組DNA作為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，與PMD18-T進(jìn)行連接； 2) 向Trans 1-T1克隆感受態(tài)中加入步驟1)獲得的連接產(chǎn)物，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的工作程序?yàn)?94°C 3min; 94°C 20s，58 °C 50s，讀板，35個(gè)循環(huán)。7. 根據(jù)權(quán)利要求4~6任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的工作體系為20μ L:Premix Ex TaqlOyL，上下游引物各0.8yL，Probe 0.6yL，模板lyL，ddH2〇補(bǔ)足。
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測引物與試劑盒，具體公開了檢測致病性犬鉤端螺旋體的熒光PCR引物、探針及試劑盒。所述引物如下：上游引物：5’-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3’；下游引物：5’-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3’；所述探針為：5ˊ-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3ˊ。本發(fā)明選擇LigB基因作為檢測對(duì)象，實(shí)現(xiàn)檢測致病性鉤端螺旋體的目的。本發(fā)明提供了省時(shí)省力，特異性和敏感性優(yōu)異，檢測致病性犬鉤端螺旋體的熒光PCR引物、探針及試劑盒。本發(fā)明提供的引物和試劑盒，可用于犬鉤端螺旋體病的早期診斷在該實(shí)驗(yàn)中，建立并組裝的犬鉤體病熒光定量PCR試劑盒檢測靈敏度為10°copies/μL，鉤體濃度檢測靈敏度為1×101鉤體/mL，可滿足檢測需要。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105624300
【申請?zhí)枴緾N201610077201
【發(fā)明人】曹永國, 丁壯, 龔悅, 金雪敏, 張文龍, 吳殿君
【申請人】吉林大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月3日