一種布魯氏菌Omp16蛋白抗原表位多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種多膚，確切講是一種布魯氏菌0mpl6蛋白抗原表位多膚及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌(Brucella),革蘭氏陰性兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，是嚴(yán)重的人獸共患病，廣泛 感染家畜、野生動物和人，家畜動物布魯氏菌主要感染羊、牛和豬，其中對人致病的主要有 馬耳他布魯氏菌和流產(chǎn)布魯氏菌;布魯氏菌病感染家畜引起公畜的附睪炎和懷孕家畜的流 產(chǎn)、胎盤炎癥和不育;對于人類，布魯氏菌病課引起急性炎癥和許多類似流感感染的癥狀， 包括波浪熱、多汗、背疼和體質(zhì)虛弱，在一些病人身上，急性臨床癥狀可持續(xù)一年W上最終 導(dǎo)致慢性的持續(xù)性感染，慢性臨床癥狀包括不規(guī)則的發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼、乏力，并發(fā)引起關(guān)節(jié)炎、 區(qū)部末梢神經(jīng)炎癥、脊柱炎、骨髓炎和粘液囊炎，布魯氏菌病的流行不僅危害著畜牧業(yè)的發(fā) 展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅著人類的健康和公共衛(wèi)生安全。
[0003] 目前，全世界用于預(yù)防布魯氏菌病的有效疫苗均為減毒的活疫苗，各種疫苗的使 用不僅干擾著疫苗免疫和自然感染的鑒別診斷，而且所有的疫苗株不同程度的對人有致病 毒力，甚至有些疫苗對人為強(qiáng)致病力，安全可靠的滅活疫苗研究效果差，不能起到免疫保護(hù) 作用?；蚬こ桃呙绲难芯拷鼛资陙硪恢北蝗澜缪芯咳藛T所關(guān)注和努力，但由于布魯 氏菌本身免疫抗原多樣化，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，未能發(fā)現(xiàn)可用于田間試驗(yàn)的疫苗抗原，尋找存在于各 種布魯氏菌種間保守存在且具有很好免疫功能的蛋白，研制預(yù)防保護(hù)力高的亞單位疫苗是 解決運(yùn)一問題的有效辦法。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)表達(dá)工具只能表達(dá)一種蛋白，而布魯氏菌存在多種與免疫相關(guān) 的蛋白，研究表明單個蛋白的表達(dá)不能形成有效的保護(hù)疫苗用抗原，表達(dá)制備多個防控作 用的亞單位疫苗成本高，且組合成分復(fù)雜；而決定免疫蛋白功能的成分是位于蛋白上微小 的抗原決定簇，對免疫相關(guān)蛋白免疫抗原表位的挖掘和鑒定，可W有效的提取布魯氏菌中 有效的免疫抗原成分，同時也對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供直接的指導(dǎo)，表位抗原成分的 確定，可為檢測、預(yù)防或治療能提供良好的抗原組分。因此篩選獲得免疫蛋白上運(yùn)些抗原決 定簇多膚為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供了一種思路和途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種布魯氏菌0mpl6蛋白抗原表位多膚及其用途。
[0006] 本發(fā)明的布魯氏菌0mpl6蛋白抗原表位多膚其氨基酸序列中含有SEQ ID NO. 1或/ 和沈Q ID NO.4或/和沈Q ID NO.3或/和沈Q ID NO.2或/和沈Q ID NO.5。
[0007] 本發(fā)明的布魯氏菌0mpl6蛋白抗原表位多膚也可W是其氨基酸序列為SEQ ID NO. 1或/和沈Q ID NO.4或/和沈Q ID NO.3或/和SEQ ID NO.2或/和沈Q ID NO.5.所示的序 列經(jīng)過一個或/和幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失形成的序列形成的多膚，或者是其氨基 酸序列為SEQ ID NO. 1或/和沈Q ID N0.4或/和SEQ ID N0.3或/和沈Q ID N0.2或/和沈Q ID NO.5所示的序列和添加有具有布魯氏菌免疫源性功能的衍生的多膚。
[000引 由SEQ ID NO. 1 或/和SEQ ID N0.4或/和SEQ ID N0.3或/和SEQ ID N0.2或/和 沈Q ID NO.5可W構(gòu)成重組載體或表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組菌。
[0009] 本發(fā)明所述的多膚可W在制備診斷或預(yù)防或治療布魯氏菌引起的疾病的試劑或 藥物中的應(yīng)用。
[0010] 6.本發(fā)明的其中有沈Q ID NO. 1或/和沈Q ID NO.4或/和SEQ ID NO.3或/和沈Q ID NO.2或/和SEQ ID NO.5的多膚可W形成一種用于治療或預(yù)防布魯氏菌的藥物組合物。
[0011] 布魯氏菌0mpl6免疫蛋白屬于第二組外膜蛋白，為一種脂蛋白，是良好的免疫學(xué)抗 原，是多種基因工程疫苗研究首選的抗原。本發(fā)明利用生物信息學(xué)的手段，對布魯氏菌 0mpl6免疫蛋白氨基酸的組成和功能進(jìn)行分析，并模擬構(gòu)建出蛋白的高級結(jié)構(gòu)模型，綜合上 述結(jié)果發(fā)掘出的蛋白上潛在的具有免疫功能的抗原多膚，化學(xué)合成運(yùn)些多膚后，通過實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證手段最終獲得功能多膚，制備出的布魯氏菌0mpl6免疫蛋白多膚為布魯氏菌病的檢測、 疫苗、防控提供新的思路，運(yùn)也對于提高我國動物布魯氏菌病的防治技術(shù)水平，保證養(yǎng)殖業(yè) 健康發(fā)展、提供農(nóng)牧民收入、保證公共衛(wèi)生和畜產(chǎn)品安全同樣具有重大的社會效益。
[0012] 本發(fā)明的有益效果為：1)本發(fā)明篩選多膚為化學(xué)合成，而不是活的布魯氏菌上提 取，因此在生產(chǎn)過程中完全避免了人為的制毒、散毒等安全隱患。2)本發(fā)明采用生物信息學(xué) 工具與試驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合篩選抗原多膚，縮小的篩選抗原多膚的范圍，提高了篩選效率。3)本 發(fā)明在樹突狀細(xì)胞上篩選抗原多膚，由于樹突狀細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗原加工和遞呈能力，結(jié) 果更為接近于動物模型。4)本發(fā)明所獲得的多膚能與布魯氏菌病陽性血清發(fā)生反應(yīng)，故該 重組蛋白可作為目的抗原檢測檢測布魯氏菌病感染的血清，如化ISA方法等。5)本發(fā)明所表 達(dá)的目的蛋白，可直接用于制備0mpl6蛋白單克隆抗體的抗原。
【附圖說明】
[OOK]圖1是本發(fā)明實(shí)施例的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)圖。
[0014] 圖2是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞的表型結(jié)果。
[0015] 圖3是本發(fā)明多膚作用樹突狀細(xì)胞后IL-2的分泌量;其中1-8依次為受試的各樣本 多膚;9為已知抗原表位對照；10為陰性對照。
[0016] 圖4是本發(fā)明多膚作用樹突狀細(xì)胞后IL-:4分泌量;其中1-8依次為受試的各樣本 多膚;9為已知抗原表位對照；10為陰性對照； 圖5是本發(fā)明多膚作用樹突狀細(xì)胞后IFN-丫分泌量;其中1-8依次為受試的各樣本多 膚;9為已知抗原表位對照；10為陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0018] -、實(shí)驗(yàn)材料的制備 1)抗原表位多膚的獲得 用生物信息學(xué)軟件對布魯氏菌L7/L12蛋白氨基酸的組成、性質(zhì)W及其高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分 析，結(jié)合所有結(jié)果，挖掘獲得可能具有免疫原性的八個多膚片段，并委托南京金斯瑞生物科 技有限公司合成，得到各多膚序列如下： 多膚序列如下： .;：至;CASKK化PNNAGDL化GAGAATPGSSQD(SEQ ID NO.l，在后述的內(nèi)容中為受試多膚樣本 1); 惡；90。1'￥曆601?1。。0〇)551^1?40(569 10^.4，在后述的內(nèi)容中為受試多膚樣本2); 這）AQQTLSKQAQWLQRYPQYSm(SEQIDN0.3，在后述的內(nèi)容中為受試多膚樣本3); ;'|)GQRRAAAT畑FLASRGVPTNRMRTI (SEQ ID NO. 2，在后述的內(nèi)容中為受試多膚樣本4); 這)5￥6肥1?口￥4￥〔0401^胖59服1?4￥(569 10獅.5，在后述的內(nèi)容中為受試多膚樣本5); 參口￥4￥〔0401'(：(569 10^.6，在后述的內(nèi)容中為受試多膚樣本6); 、透淚5141?5口1414口^〇^\￥46〔4(569 10獅.7，在后述的內(nèi)容中為受試多膚樣本7); 惡.;尸。00)551^1?40(569 10^.8，在后述的內(nèi)容中為受試多膚樣本8)。
[0019 ] 2 )小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞(DC)的培養(yǎng) 頸椎脫位法處死Babl/c小鼠，無菌狀態(tài)下取股骨和腔骨，浸泡在RPMI-1640培養(yǎng)基中。 用1ml注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液，從骨干的一端刺入骨髓腔，將骨髓沖洗到一無菌培養(yǎng) 皿中，每根骨頭反復(fù)4~6遍，收集培養(yǎng)皿中的骨髓細(xì)胞懸液，離屯、，1500巧mXlO min。棄去 上清，加入5 ml無菌化iS-NH4C1溶液懸浮細(xì)胞溶解紅細(xì)胞，于室溫下靜置2分鐘溶解紅細(xì)胞 后，再次離屯、，1500 rpmX 5 min,棄上清。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗涂后將細(xì)胞用完全培養(yǎng)基 懸浮，分至6孔培養(yǎng)板中，并在每孔中加入完全培養(yǎng)基至4 ml，再加入rmGM-CSF至終濃度10 ng/ml，化-4終濃度lOng/ml。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37°C，含5% C〇2的解箱中培養(yǎng)48~72小時。 輕輕吹打細(xì)胞后，連同培養(yǎng)液一起吸去懸浮細(xì)胞，僅保留貼壁細(xì)胞。加入新鮮的完全培養(yǎng)基 及相同濃度的rmGM-CSF，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天。半量換液，并補(bǔ)足rmGM-CSF;盡量保留懸浮細(xì) 胞。繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細(xì)胞，即為富集的小鼠骨髓來源的 樹突狀細(xì)胞(Bone marrow-derived den化itic cell, BMDC)，細(xì)胞在顯微鏡下觀察期形態(tài) 符合骨髓源樹突狀細(xì)胞的特征，參見圖1，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測的表型結(jié)果為:流式細(xì)胞檢 測細(xì)胞表面CDiiG抗體達(dá)到70%W上，證明培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞高達(dá)70%W上，能滿足實(shí)驗(yàn)要求，參 見圖2所示。
[0020] 3)多膚與DC的相互作用 收集培養(yǎng)7天的DC，計(jì)數(shù)，調(diào)整到1 X 105細(xì)胞/ml濃度，將細(xì)胞按每孔500ul接種培養(yǎng)與 48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入合成的多膚，終濃度為lOng/ml。每個多膚做3個平行 對照，同時用已經(jīng)鑒定的多膚刺激細(xì)胞培作為陽性對照，W沒刺激的細(xì)胞培養(yǎng)為空白對照， 作用30小時后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，-80°C保存，W備做忍片檢測。
[0021] 4)忍片操作流程(操作由試劑盒完成） 本發(fā)明的檢測選用RayBiotech公司的Quantibody Mouse切tokine Array 1試劑盒， 按其操作說明完成。其具體操作如下： 、:1)每個孔中加10化L的樣品稀釋液，室溫?fù)u床上解育30min，封閉定量抗體忍片。抽去 每個孔中的緩沖液，添加10化L的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品到孔中，4°C過夜解育。
[00剖蠻猜洗 抽去每個孔中的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，1 X洗液I清洗3次，每次lOmin室溫?fù)u床震蕩，每孔15化 L的1 X洗液I，每次清洗要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20 X洗液I。抽去每個孔中的1 X洗 液I，加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室