溫?fù)u床震蕩，每孔15化L的1 X洗液II，每次清洗 要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20X洗液11(所有試劑由試劑盒提供）。
[0023] III檢測抗體混合物的解育 離屯、檢測抗體混合物小管，然后加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻后再次快速離屯、。 添加8化L的檢測抗體到每個孔中，RT搖床上解育1.5小時。抽去每個孔中的檢測抗體，1 X洗 液I清洗3次，每次lOmin室溫?fù)u床震蕩，每孔15化L的1 X洗液I，每次清洗要抽干凈洗液，然 后加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室溫?fù)u床震蕩，每孔15化L的1 X洗液II，每次清洗要 抽干凈洗液。
[0024] :軍、切3-鏈霉親和素的解育 離屯、切3-鏈霉親和素小管，然后加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻后再次快速離屯、。 添加8化L的切3-鏈霉親和素到每個孔中，用侶錐紙包住玻片避光解育，RT搖床上解育1個小 時。抽去每個孔中的切3-鏈霉親和素，1 X洗液I清洗3次，每次lOmin室溫?fù)u床震蕩，每孔 15化L的1 X洗液I，每次清洗要抽干凈洗液。，然后加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室溫 搖床震蕩，每孔15化L的1 X洗液II，每次清洗要抽干凈洗液。
[0025] 戀巧光值定量檢測細(xì)胞因子 將固定忍片的玻片框架拆掉，小屯、不要用手接觸到玻片印制抗體的一面。采用激光掃 描儀例如InnoScan 300掃描信號，采用切3或者綠色通道（激發(fā)頻率=532加1)。采用QAM- CYT-1的數(shù)據(jù)分析軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0026] 二、多膚的活性功能鑒定 樣本細(xì)胞因子的忍片檢測 多膚與DC作用后的培養(yǎng)上清為樣本，樣本10倍稀釋后加入包被完好的細(xì)胞因子檢測忍 片，作用30分鐘后顯色，置于檢測儀器先對不同細(xì)胞因子顯色掃描，獲取發(fā)光強(qiáng)度值。同時 做已知陽性多膚和空白對照，并用標(biāo)準(zhǔn)品做定量對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出 樣本中細(xì)胞因子的量，其中與B細(xì)胞和T細(xì)胞多膚相關(guān)的因子有比-2、化-4和IFN-丫，具體檢 測值見圖3、圖4和圖5。
[0027] l)IL-2 分析 化-2即白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,化-2)，又名T細(xì)胞生長因子（T cell growth factor，TCRF)。主要由活化的CD4+化1細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子。可促進(jìn) 化0和CTL的增殖，故為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，也參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視。能活 化T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生；刺激NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK殺傷活性及產(chǎn)生細(xì)胞因子，誘導(dǎo)LAK 細(xì)胞產(chǎn)生;促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體;激活巨隧細(xì)胞。比-2的主要生理作用是刺激和維持T 細(xì)胞的分化增殖。因此，多膚與DC刺激后釋放IL-2的水平反應(yīng)其多膚活化T細(xì)胞免疫反應(yīng)的 能力，是評價T細(xì)胞多膚的重要指標(biāo)。本發(fā)明檢測結(jié)果表明，陽性對照多膚刺激后釋放化-2 的濃度為3.9pg/ml，與陽性對照相比，本發(fā)明實驗篩選出的多膚組多膚刺激后釋放IL-2為： 這)3.2pg/ml，感6.3 pg/ml，每4.1 pg/ml比-4,其余各樣本多膚刺激后未釋放比-2,參 見圖3。
[002引 2)IL-4 分析 細(xì)胞介素-4(白介素-4，Interleukin-4，化-4)是II型輔助T細(xì)胞(化2細(xì)胞)分泌的細(xì) 胞因子。白細(xì)胞介素-4的生物作用，包括刺激活化B細(xì)胞和Τ細(xì)胞增殖、CD4巧細(xì)胞分化成II 型輔助Τ細(xì)胞.它也在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用。白細(xì)胞介素-4誘導(dǎo)Β細(xì)胞 抗體類別轉(zhuǎn)換向I姐，為Β細(xì)胞生長因子-1 (Β cell growth factor-1，BCGF-1)。比-4促進(jìn) B細(xì)胞MHC Π 類抗原、FceRΠ /CD23和CD40的表達(dá)，并增強(qiáng)B細(xì)胞提呈抗原能力，使免疫系統(tǒng)對 小量抗原刺激發(fā)生免疫應(yīng)答。促進(jìn)巨隧細(xì)胞提呈抗原和殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，可能與調(diào)節(jié) MHCn類抗原和FcR表達(dá)有關(guān)?；?4與GM-CSF、比-3和LPS有協(xié)同作用。比-4可誘導(dǎo)外周血單 核細(xì)胞分泌G-CSF和M-CSF，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的吞隧、殺傷活性和ADCC作用。因此，化-4 分泌水平是評價多膚B細(xì)胞免疫反正能力的重要指標(biāo)。檢測結(jié)果表明，陽性對照多膚刺激后 釋放IL-4的濃度為8.5pg/ml，與陽性對照相比，本發(fā)明實驗篩選出的各樣本多膚組多膚刺 激后釋放比-4為:懇 16.8pg/ml，潑 13.5 pg/ml，霉 16.0 pg/ml(p<0.001)，?14.2 pg/ ml，'；憂17.1 pg/ml，其余Ξ個樣本多膚刺激后釋放化-4的濃度均低于陽性對照多膚刺激后 釋放IL-4的濃度，參見圖4。
[0029] 3)IFN-丫分析 干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細(xì)胞表面 受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制，其類型分為Ξ類，曰-(白細(xì)胞） 型、β-(成纖維細(xì)胞）型，丫-(淋己細(xì)胞）型；丫-干擾素（Interferon-丫，IFN-丫）是水溶性 二聚體細(xì)胞因子，是II型干擾素的唯一成員。最初叫巨隧細(xì)胞活化因子。IFN-T是I型輔助 T細(xì)胞(Thl細(xì)胞）的標(biāo)志性的細(xì)胞因子。II型輔助T細(xì)胞(Th2細(xì)胞)釋放白細(xì)胞介素-4 (IL- 4)和白細(xì)胞介素-13 (化-13)。自然殺傷細(xì)胞和CD8T細(xì)胞也產(chǎn)生丫 -干擾素。丫-干擾素通 過迅速降解RANK-RANKL信號通路的TRAF6而抑制破骨細(xì)胞形成。多膚刺激DC后丫-干擾素釋 放水平與T細(xì)胞的活化呈正相關(guān)，通過丫-干擾素的檢出通常來評價多膚是否為T細(xì)胞免疫 多膚。檢測結(jié)果表明，陽性對照多膚刺激后釋放IFN- 丫的濃度為20.3pg/ml，與陽性對照相 比，本發(fā)明實驗篩選多膚組多膚刺激后釋放IFN- 丫為:戀189. Opg/ml (p<0.0001)，愛62.5 pg/ml，透.;23.0蛇/ml，(墓 192.6pg/ml(p<0.0001)，參見圖5。
[0030] 通過W上實驗表明，利用蛋白忍片檢測刺激后細(xì)胞分泌比-2、Iレ4和IFN-y可得到如圖 3~5所示的水平，統(tǒng)計學(xué)分析檢測結(jié)果，從結(jié)果看出序列為CASKK化PNNAGDLGLGAGAATPGSSQD (即沈Q ID NO. 1，受試多膚樣本1) 和GQRRAAAT畑FLASRGVPTNRMRTI(即沈Q ID NO. 2,受試多膚樣本4)的多膚刺激DC后可 釋放IL-巧日/或IFN-丫，為T細(xì)胞表位;序列為AQQTLSKQAQWLQRYPQYSm(即沈QIDN0.3，受 試多膚樣本3)多膚分別刺激DC后可釋放IL-4,為B細(xì)胞表位多膚。其余受試樣本多膚或者不 產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，或者相應(yīng)分泌的抗體低于陽性對照多膚刺激后的分泌量。蛋白表面抗原表 位的挖掘，對研究該蛋白的免疫學(xué)功能有重要的意義，另一方面，有效的抗原表位除去了蛋 白上繁雜的非抗原決定簇，可W集中生產(chǎn)大量有效的抗原表位來用作疾病的診斷和疫苗的 開發(fā)，是疫苗用良好候選抗原；從蛋白上挖掘出有效的B細(xì)胞表位，本身就是一種良好的疾 病用診斷抗原，可W用于ELISA等血清學(xué)方法的建立，其敏感性要高于蛋白抗原本身，而篩 選出了表位多膚可W用的單克隆抗體的制備。從本發(fā)明的實驗中可見，受試樣本1至5均表 現(xiàn)出具有潛在使用可能的性質(zhì)，可作為目的抗原檢測檢測布魯氏菌病感染的血清，或制備 0mpl6蛋白單克隆抗體的抗原。
【主權(quán)項】
1. 一種布魯氏菌0mpl6蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1或/和SEQ ID N0.4或/和SEQ ID N0.3或/和SEQ ID N0.2或/和SEQ ID N0.5。2. -種布魯氏菌0mpl6蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. 1 或/和SEQ ID NO.4或/和SEQ ID NO.3或/和SEQ ID NO.2或/和SEQ ID NO.5.所示的序列經(jīng) 過一個或/和幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽。3. -種布魯氏菌0mpl6蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. 1 或/和SEQ ID NO.4或/和SEQ ID NO.3或/和SEQ ID NO. 2或/和SEQ ID NO.5所示的序列和 添加有具有布魯氏菌免疫源性功能的衍生的多肽。4. 由SEQ ID NO. 1或/和SEQ ID N0.4或/和SEQ ID N0.3或/和SEQ ID N0.2或/和SEQ ID NO.5所構(gòu)成的重組載體或表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組菌。5. 權(quán)利要求1或2或3所述的多肽在制備診斷或預(yù)防或治療布魯氏菌引起的疾病的試劑 或藥物中的應(yīng)用。6. -種治療布魯氏菌病的藥物組合物，其特征在于其中有SEQ ID NO. 1或/和SEQ ID NO.4或/和SEQ ID NO.3或/和SEQ ID NO.2或/和SEQ ID NO.5。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種布魯氏菌Omp16蛋白抗原表位多肽及其用途。本發(fā)明的多肽是：其氨基酸序列中含有SEQ？ID？N0.1或/和SEQ？ID？N0.4或/和SEQ？ID？N0.3或/和SEQ？ID？N0.2或/和SEQ？ID？N0.5所示的序列，或者經(jīng)過前述序列一個或/和幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽，也可以是前述序列所示的序列和添加有具有布魯氏菌免疫源性功能的衍生的多肽。本發(fā)明的多肽可以構(gòu)成的重組載體或表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組菌。而本發(fā)明所涉及的各多肽可在制備診斷或預(yù)防或治療布魯氏菌引起的疾病的試劑或藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明篩選多肽為化學(xué)合成，經(jīng)刺激DC后可釋放出高濃度的IL-4，可作為目的抗原檢測檢測布魯氏菌病感染的血清，或制備Omp16蛋白單克隆抗體的抗原。
【IPC分類】G01N33/569, C07K14/23, A61P31/04, A61K39/10, G01N33/68
【公開號】CN105669845
【申請?zhí)枴緾N201610233885
【發(fā)明人】曹小安, 周繼章, 李兆才, 婁忠子, 景志忠, 付寶權(quán), 尚佑軍
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年4月16日